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Die Etablierung von Tiermodellen für Modic-Veränderungen (MC) ist eine wichtige Grundlage für deren Erforschung. Vierundfünfzig Neuseeländer Weiße Kaninchen wurden in drei Gruppen eingeteilt: eine Scheinoperationsgruppe, eine Muskelimplantationsgruppe (ME-Gruppe) und eine Gruppe mit Nucleus-pulposus-Implantation (NPE-Gruppe). In der NPE-Gruppe wurde die Bandscheibe über einen anterolateralen lumbalen Zugang freigelegt und der L5-Wirbelkörper nahe der Deckplatte punktiert. Nucleus pulposus wurde mit einer Spritze aus der L1/2-Bandscheibe entnommen und in die Bandscheibe injiziert. Anschließend wurde ein Loch in den subchondralen Knochen gebohrt. Die chirurgischen Eingriffe und Bohrmethoden in der Muskelimplantationsgruppe und der Scheinoperationsgruppe entsprachen denen der Nucleus-pulposus-Implantationsgruppe. In der ME-Gruppe wurde ein Stück Muskelgewebe in das Loch eingebracht, in der Scheinoperationsgruppe hingegen nicht. Nach der Operation wurden MRT-Untersuchungen und molekularbiologische Analysen durchgeführt. Das Signal in der NPE-Gruppe veränderte sich, während in der Scheinoperationsgruppe und der ME-Gruppe keine signifikante Signalveränderung festzustellen war. Histologische Untersuchungen zeigten eine abnorme Gewebeproliferation am Implantationsort sowie eine erhöhte Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe. Die Implantation von NP in den subchondralen Knochen kann ein Tiermodell für MC darstellen.
Modic-Veränderungen (MC) sind Läsionen der Wirbelendplatten und des angrenzenden Knochenmarks, die in der Magnetresonanztomographie (MRT) sichtbar sind. Sie treten häufig bei Personen mit entsprechenden Symptomen auf1. Zahlreiche Studien haben die Bedeutung von MC aufgrund ihres Zusammenhangs mit Rückenschmerzen hervorgehoben2,3. De Roos et al.4 und Modic et al.5 beschrieben unabhängig voneinander erstmals drei verschiedene Typen subchondraler Signalveränderungen im Wirbelknochenmark. Modic-Veränderungen Typ I sind in T1-gewichteten (T1w) Sequenzen hypointens und in T2-gewichteten (T2w) Sequenzen hyperintens. Diese Läsion zeigt Fissurenendplatten und angrenzendes vaskuläres Granulationsgewebe im Knochenmark. Modic-Veränderungen Typ II weisen sowohl in T1w- als auch in T2w-Sequenzen ein hohes Signal auf. Bei diesem Läsionstyp findet sich eine Destruktion der Endplatten sowie eine histologische Fettinfiltration des angrenzenden Knochenmarks. Modic-Veränderungen Typ III zeigen ein niedriges Signal in T1w- und T2w-Sequenzen. Es wurden sklerotische Läsionen an den Endplatten beobachtet6. MC wird als pathologische Erkrankung der Wirbelsäule betrachtet und steht in engem Zusammenhang mit vielen degenerativen Erkrankungen der Wirbelsäule7,8,9.
Auf Grundlage der verfügbaren Daten haben mehrere Studien detaillierte Einblicke in die Ätiologie und die pathologischen Mechanismen der Mikrozirkulation (MC) gegeben. Albert et al. vermuteten, dass MC durch einen Bandscheibenvorfall verursacht werden könnte8. Hu et al. führten MC auf eine schwere Bandscheibendegeneration zurück10. Kroc prägte das Konzept der „internen Bandscheibenruptur“, demzufolge wiederholte Bandscheibentraumata zu Mikrorissen in der Deckplatte führen können. Nach der Spaltbildung kann die Zerstörung der Deckplatte durch den Nucleus pulposus (NP) eine Autoimmunreaktion auslösen, die wiederum zur Entwicklung von MC beiträgt11. Ma et al. vertraten eine ähnliche Ansicht und berichteten, dass die NP-induzierte Autoimmunität eine Schlüsselrolle in der Pathogenese von MC spielt12.
Zellen des Immunsystems, insbesondere CD4+ T-Helferzellen, spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen13. Die kürzlich entdeckte Th17-Subpopulation produziert das proinflammatorische Zytokin IL-17, fördert die Chemokin-Expression und stimuliert T-Zellen in geschädigten Organen zur IFN-γ-Produktion14. Auch Th2-Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Immunreaktionen. Die Expression von IL-4 durch Th2-Zellen kann schwerwiegende immunpathologische Folgen haben15.
Obwohl zahlreiche klinische Studien zu MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 durchgeführt wurden, mangelt es weiterhin an geeigneten Tiermodellen, die den beim Menschen häufig auftretenden MC-Prozess nachbilden und zur Erforschung der Ätiologie oder neuer Behandlungsansätze wie der zielgerichteten Therapie eingesetzt werden können. Bislang wurden nur wenige Tiermodelle für MC beschrieben, um die zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen zu untersuchen.
Basierend auf der von Albert und Ma vorgeschlagenen Autoimmuntheorie wurde in dieser Studie ein einfaches und reproduzierbares Kaninchenmodell für MC etabliert, indem Nucleus pulposus (NP) in der Nähe der angebohrten Wirbelendplatte autotransplantiert wurde. Weitere Ziele sind die Beobachtung der histologischen Merkmale des Tiermodells und die Untersuchung der spezifischen Mechanismen von NP bei der Entwicklung von MC. Zu diesem Zweck werden Techniken wie Molekularbiologie, MRT und histologische Untersuchungen eingesetzt, um die Progression von MC zu verfolgen.
Zwei Kaninchen verbluteten während der Operation, vier weitere starben während der Narkose bei der MRT-Untersuchung. Die übrigen 48 Kaninchen überlebten und zeigten nach der Operation keine Verhaltensauffälligkeiten oder neurologischen Symptome.
Die MRT-Untersuchung zeigt, dass die Signalintensität des eingebetteten Gewebes in den verschiedenen Bohrlöchern unterschiedlich ist. Die Signalintensität des L5-Wirbelkörpers in der NPE-Gruppe veränderte sich 12, 16 und 20 Wochen nach der Implantation allmählich (die T1-gewichtete Sequenz zeigte ein niedriges Signal, die T2-gewichtete Sequenz ein gemischtes Signal plus niedriges Signal) (Abb. 1C), während das MRT-Bild der eingebetteten Gewebeteile in den beiden anderen Gruppen im gleichen Zeitraum relativ stabil blieb (Abb. 1A, B).
(A) Repräsentative sequentielle MRT-Aufnahmen der Lendenwirbelsäule von Kaninchen zu drei Zeitpunkten. In den Aufnahmen der Scheinoperationsgruppe wurden keine Signalveränderungen festgestellt. (B) Die Signalcharakteristika des Wirbelkörpers in der ME-Gruppe ähneln denen der Scheinoperationsgruppe, und es ist keine signifikante Signaländerung an der Einbettungsstelle im Zeitverlauf zu beobachten. (C) In der NPE-Gruppe ist das niedrige Signal in der T1-gewichteten Sequenz deutlich sichtbar, und das gemischte Signal sowie das niedrige Signal sind in der T2-gewichteten Sequenz deutlich erkennbar. Zwischen der 12. und der 20. Woche nehmen die sporadischen hohen Signale, die die niedrigen Signale in der T2-gewichteten Sequenz umgeben, ab.
Eine deutliche Knochenhyperplasie ist an der Implantationsstelle des Wirbelkörpers in der NPE-Gruppe zu erkennen, und die Knochenhyperplasie tritt zwischen der 12. und 20. Woche schneller auf (Abb. 2C). Im Vergleich dazu ist in der Sham-Gruppe und der ME-Gruppe keine signifikante Veränderung der modellierten Wirbelkörper zu beobachten (Abb. 2C) 2A,B).
(A) Die Oberfläche des Wirbelkörpers im Bereich des Implantats ist sehr glatt, die Wunde verheilt gut, und es liegt keine Hyperplasie im Wirbelkörper vor. (B) Die Form der Implantationsstelle in der ME-Gruppe ähnelt derjenigen in der Scheinoperationsgruppe, und es zeigen sich keine wesentlichen Veränderungen im Erscheinungsbild der Implantationsstelle im Laufe der Zeit. (C) In der NPE-Gruppe trat eine Knochenhyperplasie an der Implantationsstelle auf. Die Knochenhyperplasie nahm rasch zu und dehnte sich sogar durch die Bandscheibe auf den kontralateralen Wirbelkörper aus.
Die histologische Analyse liefert detailliertere Informationen über die Knochenbildung. Abbildung 3 zeigt die Fotos der postoperativen, mit H&E gefärbten Schnitte. In der Scheinoperationsgruppe waren die Chondrozyten gut angeordnet, und es wurde keine Zellproliferation festgestellt (Abb. 3A). Die Situation in der ME-Gruppe war ähnlich wie in der Scheinoperationsgruppe (Abb. 3B). In der NPE-Gruppe hingegen wurde am Implantationsort eine große Anzahl von Chondrozyten und eine Proliferation von NP-ähnlichen Zellen beobachtet (Abb. 3C).
(A) In der Nähe der Endplatte sind Trabekel sichtbar. Die Chondrozyten sind gleichmäßig angeordnet, weisen eine einheitliche Zellgröße und -form auf und zeigen keine Proliferation (40-fache Vergrößerung). (B) Der Zustand der Implantationsstelle in der ME-Gruppe ähnelt dem der Kontrollgruppe. Trabekel und Chondrozyten sind sichtbar, jedoch ist keine deutliche Proliferation an der Implantationsstelle erkennbar (40-fache Vergrößerung). (C) Es zeigt sich, dass Chondrozyten und NP-ähnliche Zellen signifikant proliferieren und die Chondrozyten eine uneinheitliche Form und Größe aufweisen (40-fache Vergrößerung).
Die Expression von Interleukin-4 (IL-4)-mRNA, Interleukin-17 (IL-17)-mRNA und Interferon-γ (IFN-γ)-mRNA wurde sowohl in der NPE- als auch in der ME-Gruppe beobachtet. Im Vergleich der Expressionsniveaus der Zielgene war die Genexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe im Vergleich zur ME-Gruppe und der Scheinoperationsgruppe signifikant erhöht (Abb. 4) (p < 0,05). Im Vergleich zur Scheinoperationsgruppe war die Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der ME-Gruppe nur geringfügig erhöht und erreichte keine statistische Signifikanz (p > 0,05).
Die mRNA-Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe zeigte einen signifikant höheren Trend als in der Scheinoperationsgruppe und der ME-Gruppe (P < 0,05).
Im Gegensatz dazu zeigten die Expressionswerte in der ME-Gruppe keinen signifikanten Unterschied (P>0,05).
Um das veränderte mRNA-Expressionsmuster zu bestätigen, wurde eine Western-Blot-Analyse mit kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen IL-4 und IL-17 durchgeführt. Wie in Abbildung 5A und 5B dargestellt, waren die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der NPE-Gruppe im Vergleich zur ME-Gruppe und zur Scheinoperationsgruppe signifikant erhöht (p < 0,05). Im Vergleich zur Scheinoperationsgruppe zeigten die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der ME-Gruppe jedoch keine statistisch signifikanten Veränderungen (p > 0,05).
(A) Die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 waren in der NPE-Gruppe signifikant höher als in der ME-Gruppe und der Placebo-Gruppe (P < 0,05). (B) Western-Blot-Histogramm.
Aufgrund der begrenzten Anzahl an humanen Proben, die während chirurgischer Eingriffe gewonnen werden, sind aussagekräftige und detaillierte Studien zur Pathogenese der mikroskopischen Karzinome (MC) schwierig. Wir haben daher versucht, ein Tiermodell für MC zu etablieren, um dessen potenzielle pathologische Mechanismen zu untersuchen. Gleichzeitig wurden radiologische, histologische und molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt, um den Verlauf der durch NP-Autograft induzierten MC zu verfolgen. Die Ergebnisse des NP-Implantationsmodells zeigten eine allmähliche Veränderung der Signalintensität zwischen der 12. und 20. Woche (gemischt niedriges Signal in T1w- und T2w-Sequenzen), was auf Gewebeveränderungen hindeutet. Die histologischen und molekularbiologischen Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse der radiologischen Studie.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass im Bereich der Wirbelkörperkompression in der NPE-Gruppe visuelle und histologische Veränderungen auftraten. Gleichzeitig wurde die Expression der Gene für IL-4, IL-17 und IFN-γ sowie die Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Kompression des Wirbelkörpers durch autologes Nucleus-pulposus-Gewebe eine Reihe von Signal- und morphologischen Veränderungen hervorrufen kann. Die Signalcharakteristika der Wirbelkörper des Tiermodells (niedriges Signal in der T1w-Sequenz, gemischtes und niedriges Signal in der T2w-Sequenz) ähneln stark denen menschlicher Wirbelzellen. Die MRT-Befunde bestätigen die histologischen und makroskopischen Beobachtungen, d. h. die Veränderungen der Wirbelkörperzellen verlaufen progressiv. Obwohl die durch ein akutes Trauma ausgelöste Entzündungsreaktion kurz nach der Punktion auftreten kann, zeigten MRT-Untersuchungen, dass sich die Signalveränderungen erst 12 Wochen nach der Punktion zunehmend verstärkten und bis zu 20 Wochen lang anhielten, ohne dass Anzeichen einer Erholung oder einer Rückbildung der MRT-Veränderungen erkennbar waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die autologe Vertebralpunktion eine zuverlässige Methode zur Etablierung einer progressiven mechanischen Kreislaufinstabilität (MV) bei Kaninchen darstellt.
Dieses Punktionsmodell erfordert ausreichend Geschick, Zeit und chirurgischen Aufwand. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass eine Präparation oder übermäßige Stimulation der paravertebralen Bandstrukturen zur Bildung von Wirbelosteophyten führen kann. Es ist darauf zu achten, die angrenzenden Bandscheiben nicht zu beschädigen oder zu reizen. Da die Eindringtiefe kontrolliert werden muss, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, wurde manuell ein Stopfen hergestellt, indem die Schutzhülle einer 3 mm langen Nadel abgeschnitten wurde. Dieser Stopfen gewährleistet eine gleichmäßige Bohrtiefe im Wirbelkörper. In Vorversuchen empfanden drei an der Operation beteiligte Orthopäden die Verwendung von 16-Gauge-Nadeln als einfacher als die von 18-Gauge-Nadeln oder anderen Methoden. Um übermäßige Blutungen während des Bohrens zu vermeiden, kann die Nadel kurzzeitig ruhig gehalten werden, wodurch ein geeigneteres Einstichloch entsteht. Dies deutet darauf hin, dass sich ein gewisses Maß an Mikrozirkulation auf diese Weise kontrollieren lässt.
Obwohl MC bereits in zahlreichen Studien untersucht wurde, ist die Ätiologie und Pathogenese von MC25,26,27 noch weitgehend unerforscht. Aus unseren vorherigen Untersuchungen geht hervor, dass Autoimmunität eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und Entwicklung von MC12 spielt. In der vorliegenden Studie wurde die quantitative Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ untersucht, den wichtigsten Differenzierungswegen von CD4+-Zellen nach Antigenstimulation. Im Vergleich zur Negativkontrolle zeigte die NPE-Gruppe eine höhere Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ sowie höhere Proteinspiegel von IL-4 und IL-17.
Klinisch ist die IL-17-mRNA-Expression in NP-Zellen von Patienten mit Bandscheibenvorfall erhöht28. Auch in einem akuten, nicht-kompressiven Bandscheibenvorfallmodell wurden im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöhte IL-4- und IFN-γ-Expressionswerte gefunden29. IL-17 spielt eine Schlüsselrolle bei Entzündungen und Gewebeschädigungen bei Autoimmunerkrankungen30 und verstärkt die Immunantwort auf IFN-γ31. Eine verstärkte IL-17-vermittelte Gewebeschädigung wurde in MRL/lpr-Mäusen32 und in autoimmunanfälligen Mäusen33 beschrieben. IL-4 kann die Expression proinflammatorischer Zytokine (wie IL-1β und TNFα) und die Makrophagenaktivierung hemmen34. Es wurde berichtet, dass die mRNA-Expression von IL-4 in der NPE-Gruppe im Vergleich zu IL-17 und IFN-γ zum gleichen Zeitpunkt unterschiedlich war; die mRNA-Expression von IFN-γ war in der NPE-Gruppe signifikant höher als in den anderen Gruppen. Daher könnte die IFN-γ-Produktion ein Mediator der durch NP-Interkalation induzierten Entzündungsreaktion sein. Studien haben gezeigt, dass IFN-γ von verschiedenen Zelltypen produziert wird, darunter aktivierte Typ-1-Helferzellen, natürliche Killerzellen und Makrophagen35,36, und ein wichtiges proinflammatorisches Zytokin darstellt, das Immunreaktionen fördert37.
Diese Studie legt nahe, dass Autoimmunreaktionen an der Entstehung und Entwicklung von MC beteiligt sein könnten. Luoma et al. fanden heraus, dass die Signalcharakteristika von MC und prominentem NP in der MRT ähnlich sind und beide in der T2w-Sequenz ein hohes Signal aufweisen38. Es wurde bestätigt, dass einige Zytokine, wie z. B. IL-139, eng mit der Entstehung von MC assoziiert sind. Ma et al. vermuteten, dass die nach oben oder unten gerichtete Vorwölbung des NP einen großen Einfluss auf die Entstehung und Entwicklung von MC haben könnte12. Bobechko40 und Herzbein et al.41 berichteten, dass der NP ein immunotolerantes Gewebe ist, das von Geburt an nicht in den Blutkreislauf gelangen kann. NP-Vorwölbungen führen Fremdkörper in die Blutversorgung ein und vermitteln dadurch lokale Autoimmunreaktionen42. Autoimmunreaktionen können eine Vielzahl von Immunfaktoren induzieren, und wenn diese Faktoren kontinuierlich auf Gewebe einwirken, können sie Veränderungen in der Signalübertragung hervorrufen43. In dieser Studie erwiesen sich die Überexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ als typische Immunfaktoren und belegten die enge Beziehung zwischen NP und MCs44. Dieses Tiermodell bildet den Durchbruch der NP und deren Eintritt in die motorische Endplatte gut nach. Dieser Prozess verdeutlichte zudem den Einfluss von Autoimmunität auf MC.
Wie erwartet, bietet dieses Tiermodell eine mögliche Plattform zur Untersuchung der Modic-Veränderung. Allerdings weist es noch einige Einschränkungen auf: Erstens müssen während der Beobachtungsphase einige Kaninchen im Zwischenstadium für histologische und molekularbiologische Untersuchungen euthanasiert werden, wodurch einige Tiere im Laufe der Zeit ausfallen. Zweitens wurde in dieser Studie zwar ein einziger Modic-Typ (Modic-Typ-I-Veränderung) modelliert, was den Krankheitsverlauf beim Menschen nicht adäquat abbildet. Um alle Signalveränderungen besser zu beobachten, wären weitere Messzeitpunkte erforderlich. Drittens lassen sich die Veränderungen der Gewebestruktur zwar histologisch gut darstellen, jedoch können spezielle Techniken die mikrostrukturellen Veränderungen in diesem Modell besser sichtbar machen. Beispielsweise wurde die Bildung von Faserknorpel in Kaninchenbandscheiben mittels Polarisationsmikroskopie analysiert.45 Die Langzeitwirkungen von NP auf die Modic-Veränderung und die Endplatte bedürfen weiterer Untersuchungen.
Vierundfünfzig männliche Neuseeländer-Kaninchen (Gewicht ca. 2,5–3 kg, Alter 3–3,5 Monate) wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: eine Scheinoperationsgruppe, eine Muskelimplantationsgruppe (ME-Gruppe) und eine Nervenwurzelimplantationsgruppe (NPE-Gruppe). Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission des Tianjin-Krankenhauses genehmigt und die experimentellen Methoden in strikter Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.
Die Operationstechnik von S. Sobajima46 wurde in einigen Punkten verbessert. Jedes Kaninchen wurde in Seitenlage positioniert, und die Vorderseite von fünf aufeinanderfolgenden lumbalen Bandscheiben wurde über einen posterolateralen retroperitonealen Zugang freigelegt. Die Kaninchen erhielten eine Allgemeinanästhesie (20%iges Urethan, 5 ml/kg über die Ohrvene). Ein Längsschnitt wurde von der Unterkante der Rippen bis zum Beckenrand, 2 cm ventral der paravertebralen Muskulatur, durchgeführt. Die rechte anterolaterale Wirbelsäule von L1 bis L6 wurde durch scharfe und stumpfe Präparation des darüberliegenden subkutanen Gewebes, des retroperitonealen Gewebes und der Muskulatur freigelegt (Abb. 6A). Die Bandscheibenhöhe wurde anhand des Beckenrandes als anatomischer Orientierungspunkt für die Bandscheibe L5/L6 bestimmt. Mit einer 16-Gauge-Punktionsnadel wird nahe der Deckplatte des L5-Wirbels ein 3 mm tiefes Loch gebohrt (Abb. 6B). Anschließend wird mit einer 5-ml-Spritze autologer Nucleus pulposus aus der Bandscheibe L1-L2 aspiriert (Abb. 6C). Je nach Bedarf der jeweiligen Gruppe wird der Nucleus pulposus oder Muskel entfernt. Nach Vertiefung des Bohrlochs werden resorbierbare Fäden in die tiefe und oberflächliche Faszie sowie die Haut eingebracht. Dabei ist darauf zu achten, das Periost des Wirbelkörpers während des Eingriffs nicht zu verletzen.
(A) Die Bandscheibe L5–L6 wird über einen posterolateralen retroperitonealen Zugang freigelegt. (B) Mit einer 16-Gauge-Kanüle wird ein Loch nahe der L5-Endplatte gebohrt. (C) Autologe Myofibrillen werden entnommen.
Die Allgemeinanästhesie erfolgte mit 20%igem Urethan (5 ml/kg), das über die Ohrvene verabreicht wurde. Röntgenaufnahmen der Lendenwirbelsäule wurden 12, 16 und 20 Wochen nach der Operation wiederholt.
Kaninchen wurden 12, 16 und 20 Wochen nach der Operation durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (25,0 mg/kg) und intravenöse Gabe von Natrium-Pentobarbital (1,2 g/kg) euthanasiert. Die gesamte Wirbelsäule wurde für histologische Untersuchungen entnommen und analysiert. Quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (RT-qPCR) und Western Blotting wurden eingesetzt, um Veränderungen von Immunfaktoren zu untersuchen.
Die MRT-Untersuchungen an Kaninchen wurden mit einem 3,0-T-MRT-Gerät (GE Medical Systems, Florence, SC) mit orthogonaler Extremitätenspule durchgeführt. Die Kaninchen wurden über die Ohrvene mit 20%igem Urethan (5 ml/kg) anästhesiert und anschließend in Rückenlage im MRT-Gerät positioniert, wobei die Lendenregion auf einer kreisförmigen Oberflächenspule mit 5 Zoll Durchmesser (GE Medical Systems) zentriert war. Koronare T2-gewichtete Lokalisationsaufnahmen (TR 1445 ms; TE 37 ms) wurden angefertigt, um die Lage der Bandscheibe von L3–L4 bis L5–L6 zu bestimmen. Sagittale T2-gewichtete Schichten wurden mit folgenden Einstellungen akquiriert: schnelle Spin-Echo-Sequenz mit einer Repetitionszeit (TR) von 2200 ms und einer Echozeit (TE) von 70 ms; Matrix: 260°; Sichtfeld: 8 Stimuli; Schnittdicke: 2 mm; Schichtabstand: 0,2 mm.
Nachdem das letzte Foto aufgenommen und das letzte Kaninchen getötet worden war, wurden die Schein-, Muskel- und Nucleus-pulposus-Gewebe für die histologische Untersuchung entnommen. Die Gewebeproben wurden eine Woche lang in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, mit Ethylendiamintetraessigsäure entkalkt und in Paraffin eingebettet. Die Gewebeblöcke wurden in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom in 5 µm dicke Sagittalschnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt.
Nach der Entnahme der Bandscheiben der Kaninchen aus jeder Gruppe wurde die Gesamt-RNA mithilfe einer UNIQ-10-Säule (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) gemäß den Herstellerangaben und einem ImProm II Reverse-Transkriptionssystem (Promega Inc., Madison, WI, USA) extrahiert. Anschließend wurde die Reverse Transkription durchgeführt.
Die RT-qPCR wurde mit einem Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) und SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Das PCR-Reaktionsvolumen betrug 20 μl und enthielt 1,5 μl verdünnte cDNA sowie 0,2 μM jedes Primers. Die Primer wurden mit OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) entworfen und von Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) hergestellt (Tabelle 1). Folgende Thermocycler-Bedingungen wurden verwendet: initiale Polymerase-Aktivierung bei 94 °C für 2 min, anschließend 40 Zyklen mit jeweils 15 s bei 94 °C zur Denaturierung der DNA-Vorlage, 1 min bei 60 °C zur Annealing-Phase und Elongation. Die Fluoreszenzmessungen erfolgten 1 min bei 72 °C. Alle Proben wurden dreimal amplifiziert, und der Mittelwert wurde für die RT-qPCR-Analyse verwendet. Die Amplifikationsdaten wurden mit FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) analysiert. Die Genexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ wurde auf die endogene Kontrolle (ACTB) normalisiert. Die relative Expression der Ziel-mRNA wurde mit der 2-ΔΔCT-Methode berechnet.
Gesamtprotein wurde aus Gewebeproben mittels eines Gewebehomogenisators in RIPA-Lysepuffer (mit einem Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktail) extrahiert und anschließend 20 min bei 13.000 U/min und 4 °C zentrifugiert, um Gewebetrümmer zu entfernen. Fünfzig Mikrogramm Protein wurden pro Spur aufgetragen, mittels 10%iger SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Blockierung erfolgte in 5%iger fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) mit 0,1% Tween 20 für 1 h bei Raumtemperatur. Die Membran wurde über Nacht bei 4 °C mit primären Kaninchen-Anti-Decorin-Antikörpern (1:200 verdünnt; Boster, Wuhan, China) und Bioss, Peking, China (1:200 verdünnt) inkubiert und am zweiten Tag inkubiert. Die Inkubation erfolgte mit einem sekundären Antikörper (Ziege-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G, Verdünnung 1:40.000) in Kombination mit Meerrettichperoxidase (Boster, Wuhan, China) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Western-Blot-Signale wurden durch die erhöhte Chemilumineszenz auf der chemilumineszenten Membran nach Röntgenbestrahlung detektiert. Für die densitometrische Analyse wurden die Blots gescannt und mit der Software BandScan quantifiziert. Die Ergebnisse wurden als Verhältnis der Immunreaktivität des Zielgens zur Tubulin-Immunreaktivität dargestellt.
Die statistischen Berechnungen wurden mit dem Softwarepaket SPSS 16.0 (SPSS, USA) durchgeführt. Die erhobenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) angegeben und mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholung (ANOVA) analysiert, um Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu ermitteln. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Die Etablierung eines Tiermodells der MC durch Implantation autologer NPs in den Wirbelkörper und die Durchführung makroanatomischer Beobachtungen, MRT-Analysen, histologischer Auswertungen und molekularbiologischer Analysen könnte somit ein wichtiges Instrument zur Beurteilung und zum Verständnis der Mechanismen der menschlichen MC und zur Entwicklung neuer therapeutischer Interventionen werden.
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Veröffentlichungsdatum: 13. Dezember 2024