Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com. Die von Ihnen verwendete Browserversion bietet eingeschränkte CSS-Unterstützung. Für optimale Ergebnisse empfehlen wir die Verwendung eines neueren Browsers (oder die Deaktivierung des Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer). Um weiterhin Support zu gewährleisten, werden wir die Website in der Zwischenzeit ohne Stile und JavaScript anzeigen.
Die Etablierung von Tiermodellen des Modischen Wandels (MC) ist eine wichtige Grundlage für die Untersuchung von MC. Vierundfünfzig weiße Neuseeland-Kaninchen wurden in eine Scheinoperationsgruppe, eine Muskelimplantationsgruppe (ME-Gruppe) und eine Nucleus-pulposus-Implantationsgruppe (NPE-Gruppe) eingeteilt. In der NPE-Gruppe wurde die Bandscheibe durch einen anterolateralen lumbalen chirurgischen Ansatz freigelegt und eine Nadel verwendet, um den L5-Wirbelkörper in der Nähe der Endplatte zu punktieren. NP wurde mit einer Spritze aus der Bandscheibe L1/2 extrahiert und in diese injiziert. Bohren eines Lochs in den subchondralen Knochen. Die chirurgischen Eingriffe und Bohrmethoden in der Muskelimplantationsgruppe und der Scheinoperationsgruppe waren die gleichen wie in der NP-Implantationsgruppe. In der ME-Gruppe wurde ein Muskelstück in das Loch gelegt, während in der Scheinoperationsgruppe nichts in das Loch gelegt wurde. Nach der Operation wurden eine MRT-Untersuchung und molekularbiologische Tests durchgeführt. Das Signal in der NPE-Gruppe änderte sich, aber es gab keine offensichtliche Signaländerung in der Scheinoperationsgruppe und der ME-Gruppe. Die histologische Beobachtung zeigte, dass an der Implantationsstelle eine abnormale Gewebeproliferation beobachtet wurde und die Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe erhöht war. Die Implantation von NP in den subchondralen Knochen kann ein Tiermodell für MC bilden.
Modische Veränderungen (MC) sind Läsionen der Wirbelendplatten und des angrenzenden Knochenmarks, die in der Magnetresonanztomographie (MRT) sichtbar sind. Sie kommen recht häufig bei Personen mit damit verbundenen Symptomen vor1. Viele Studien haben die Bedeutung von MC aufgrund seines Zusammenhangs mit Schmerzen im unteren Rücken (LBP) betont2,3. de Roos et al.4 und Modic et al.5 beschrieben unabhängig voneinander zunächst drei verschiedene Arten subchondraler Signalanomalien im Wirbelknochenmark. Modische Typ-I-Veränderungen sind in T1-gewichteten (T1W) Sequenzen hypointens und in T2-gewichteten (T2W) Sequenzen hyperintens. Diese Läsion zeigt Fissurenendplatten und angrenzendes Gefäßgranulationsgewebe im Knochenmark. Modische Typ-II-Veränderungen zeigen ein hohes Signal sowohl in der T1W- als auch in der T2W-Sequenz. Bei dieser Art von Läsion kann es zu einer Zerstörung der Endplatte sowie zu einem histologischen Fettersatz des angrenzenden Knochenmarks kommen. Veränderungen vom Modischen Typ III zeigen ein niedriges Signal in den T1W- und T2W-Sequenzen. Es wurden sklerotische Läsionen beobachtet, die den Endplatten entsprechen6. MC gilt als pathologische Erkrankung der Wirbelsäule und steht in engem Zusammenhang mit vielen degenerativen Erkrankungen der Wirbelsäule7,8,9.
Unter Berücksichtigung der verfügbaren Daten haben mehrere Studien detaillierte Einblicke in die Ätiologie und pathologischen Mechanismen von MC geliefert. Albert et al. deuteten darauf hin, dass MC durch einen Bandscheibenvorfall verursacht werden könnte8. Hu et al. führten MC auf eine schwere Bandscheibendegeneration zurück10. Kroc schlug das Konzept des „internen Bandscheibenrisses“ vor, das besagt, dass wiederholte Bandscheibenverletzungen zu Mikrorissen in der Endplatte führen können. Nach der Spaltbildung kann die Zerstörung der Endplatte durch den Nucleus Pulposus (NP) eine Autoimmunreaktion auslösen, die weiter zur Entwicklung von MC11 führt. Ma et al. teilten eine ähnliche Ansicht und berichteten, dass NP-induzierte Autoimmunität eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von MC12 spielt.
Zellen des Immunsystems, insbesondere CD4+-T-Helferlymphozyten, spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Autoimmunität13. Die kürzlich entdeckte Th17-Untergruppe produziert das proinflammatorische Zytokin IL-17, fördert die Chemokinexpression und regt T-Zellen in geschädigten Organen zur Produktion von IFN-γ14 an. Th2-Zellen spielen auch eine einzigartige Rolle bei der Pathogenese von Immunantworten. Die Expression von IL-4 als repräsentative Th2-Zelle kann zu schwerwiegenden immunpathologischen Folgen führen15.
Obwohl viele klinische Studien zu MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 durchgeführt wurden, mangelt es immer noch an geeigneten Tierversuchsmodellen, die den beim Menschen häufig auftretenden MC-Prozess nachahmen können und können werden zur Erforschung der Ätiologie oder neuer Behandlungsmethoden wie gezielter Therapie eingesetzt. Bisher wurden nur wenige MC-Tiermodelle zur Untersuchung der zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen beschrieben.
Basierend auf der von Albert und Ma vorgeschlagenen Autoimmuntheorie erstellte diese Studie ein einfaches und reproduzierbares Kaninchen-MC-Modell durch Autotransplantation von NP in der Nähe der gebohrten Wirbelendplatte. Weitere Ziele sind die Beobachtung der histologischen Merkmale der Tiermodelle und die Bewertung der spezifischen Mechanismen von NP bei der Entwicklung von MC. Zu diesem Zweck nutzen wir Techniken wie Molekularbiologie, MRT und histologische Untersuchungen, um den Verlauf von MC zu untersuchen.
Zwei Kaninchen starben während der Operation an Blutungen und vier Kaninchen starben während der Narkose während der MRT. Die restlichen 48 Kaninchen überlebten und zeigten nach der Operation keine Verhaltens- oder neurologischen Anzeichen.
Die MRT zeigt, dass die Signalintensität des eingebetteten Gewebes in verschiedenen Löchern unterschiedlich ist. Die Signalintensität des L5-Wirbelkörpers in der NPE-Gruppe änderte sich allmählich 12, 16 und 20 Wochen nach dem Einsetzen (die T1W-Sequenz zeigte ein niedriges Signal und die T2W-Sequenz zeigte ein gemischtes Signal plus ein niedriges Signal) (Abb. 1C), während die MRT-Aufnahmen auftraten der anderen beiden Gruppen eingebetteter Teile blieben im gleichen Zeitraum relativ stabil (Abb. 1A, B).
(A) Repräsentative sequentielle MRTs der Lendenwirbelsäule des Kaninchens zu drei Zeitpunkten. In den Bildern der Scheinoperationsgruppe wurden keine Signalanomalien festgestellt. (B) Die Signaleigenschaften des Wirbelkörpers in der ME-Gruppe ähneln denen in der Scheinoperationsgruppe, und an der Einbettungsstelle wird im Laufe der Zeit keine signifikante Signalveränderung beobachtet. (C) In der NPE-Gruppe ist das niedrige Signal in der T1W-Sequenz deutlich sichtbar, und das gemischte Signal und das niedrige Signal sind in der T2W-Sequenz deutlich sichtbar. Vom 12-Wochen-Zeitraum bis zum 20-Wochen-Zeitraum nehmen die sporadisch hohen Signale rund um die niedrigen Signale in der T2W-Sequenz ab.
An der Implantationsstelle des Wirbelkörpers ist in der NPE-Gruppe eine offensichtliche Knochenhyperplasie zu erkennen, und die Knochenhyperplasie tritt nach 12 bis 20 Wochen schneller auf (Abb. 2C). Im Vergleich zur NPE-Gruppe ist keine signifikante Veränderung am modellierten Wirbelkörper zu beobachten Körper; Scheingruppe und ME-Gruppe (Abb. 2C) 2A,B).
(A) Die Oberfläche des Wirbelkörpers am implantierten Teil ist sehr glatt, das Loch heilt gut und es liegt keine Hyperplasie im Wirbelkörper vor. (B) Die Form der Implantationsstelle in der ME-Gruppe ähnelt der in der Scheinoperationsgruppe, und es gibt keine offensichtliche Veränderung im Aussehen der Implantationsstelle im Laufe der Zeit. (C) In der NPE-Gruppe trat an der Implantationsstelle eine Knochenhyperplasie auf. Die Knochenhyperplasie nahm schnell zu und breitete sich sogar über die Bandscheibe bis zum kontralateralen Wirbelkörper aus.
Die histologische Analyse liefert detailliertere Informationen über die Knochenbildung. Abbildung 3 zeigt die Fotos der mit H&E gefärbten postoperativen Schnitte. In der Scheinoperationsgruppe waren die Chondrozyten gut angeordnet und es wurde keine Zellproliferation festgestellt (Abb. 3A). Die Situation in der ME-Gruppe war ähnlich wie in der Scheinoperationsgruppe (Abb. 3B). In der NPE-Gruppe wurde jedoch eine große Anzahl von Chondrozyten und eine Proliferation NP-ähnlicher Zellen an der Implantationsstelle beobachtet (Abb. 3C);
(A) Trabekel sind in der Nähe der Endplatte zu sehen, die Chondrozyten sind sauber angeordnet, haben eine einheitliche Zellgröße und -form und keine Proliferation (40-mal). (B) Der Zustand der Implantationsstelle in der ME-Gruppe ähnelt dem in der Scheingruppe. Es sind Trabekel und Chondrozyten zu erkennen, es gibt jedoch keine offensichtliche Proliferation an der Implantationsstelle (40 Mal). (B) Es ist ersichtlich, dass sich Chondrozyten und NP-ähnliche Zellen deutlich vermehren und die Form und Größe der Chondrozyten ungleichmäßig ist (40-fach).
Die Expression von Interleukin 4 (IL-4)-mRNA, Interleukin 17 (IL-17)-mRNA und Interferon γ (IFN-γ)-mRNA wurde sowohl in der NPE- als auch in der ME-Gruppe beobachtet. Beim Vergleich der Expressionsniveaus der Zielgene waren die Genexpressionen von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe im Vergleich zu denen der ME-Gruppe und der Scheinoperationsgruppe signifikant erhöht (Abb. 4). (P < 0,05). Im Vergleich zur Scheinoperationsgruppe stiegen die Expressionsniveaus von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der ME-Gruppe nur geringfügig an und erreichten keine statistische Veränderung (P > 0,05).
Die mRNA-Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe zeigte einen signifikant höheren Trend als in der Scheinoperationsgruppe und der ME-Gruppe (P < 0,05).
Im Gegensatz dazu zeigten die Expressionsniveaus in der ME-Gruppe keinen signifikanten Unterschied (P > 0,05).
Zur Bestätigung des veränderten mRNA-Expressionsmusters wurde eine Western-Blot-Analyse mit kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen IL-4 und IL-17 durchgeführt. Wie in den Abbildungen 5A und B gezeigt, waren die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der NPE-Gruppe im Vergleich zur ME-Gruppe und der Scheinoperationsgruppe signifikant erhöht (P < 0,05). Im Vergleich zur Scheinoperationsgruppe erreichten die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der ME-Gruppe ebenfalls keine statistisch signifikanten Veränderungen (P > 0,05).
(A) Die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der NPE-Gruppe waren signifikant höher als die in der ME-Gruppe und der Placebo-Gruppe (P < 0,05). (B) Western-Blot-Histogramm.
Aufgrund der begrenzten Anzahl menschlicher Proben, die während der Operation gewonnen werden, sind eindeutige und detaillierte Studien zur Pathogenese von MC etwas schwierig. Wir haben versucht, ein Tiermodell für MC zu etablieren, um seine möglichen pathologischen Mechanismen zu untersuchen. Gleichzeitig wurden radiologische Untersuchungen, histologische Untersuchungen und molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt, um den Verlauf der durch NP-Autotransplantate induzierten MC zu verfolgen. Infolgedessen führte das NP-Implantationsmodell zu einer allmählichen Änderung der Signalintensität von 12-Wochen- auf 20-Wochen-Zeitpunkten (gemischtes niedriges Signal in T1W-Sequenzen und niedriges Signal in T2W-Sequenzen), was auf Gewebeveränderungen sowie histologische und molekulare Veränderungen hinweist Biologische Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse der radiologischen Untersuchung.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass in der NPE-Gruppe visuelle und histologische Veränderungen an der Stelle der Wirbelkörperverletzung auftraten. Gleichzeitig wurde die Expression der Gene IL-4, IL-17 und IFN-γ sowie IL-4, IL-17 und IFN-γ beobachtet, was auf eine Verletzung des autologen Nucleus-pulposus-Gewebes im Wirbelkörper hinweist Der Körper kann eine Reihe von Signal- und morphologischen Veränderungen verursachen. Es ist leicht festzustellen, dass die Signaleigenschaften der Wirbelkörper des Tiermodells (niedriges Signal in der T1W-Sequenz, gemischtes Signal und niedriges Signal in der T2W-Sequenz) denen menschlicher Wirbelzellen sehr ähnlich sind, ebenso wie die MRT-Eigenschaften bestätigen die Beobachtungen der Histologie und der groben Anatomie, das heißt, die Veränderungen in den Wirbelkörperzellen sind fortschreitend. Obwohl die durch ein akutes Trauma verursachte Entzündungsreaktion kurz nach der Punktion auftreten kann, zeigten die MRT-Ergebnisse, dass 12 Wochen nach der Punktion zunehmend zunehmende Signalveränderungen auftraten und bis zu 20 Wochen anhielten, ohne dass es Anzeichen einer Erholung oder Umkehrung der MRT-Veränderungen gab. Diese Ergebnisse legen nahe, dass autologe vertebrale NP eine zuverlässige Methode zur Feststellung einer progressiven MV bei Kaninchen ist.
Dieses Punktionsmodell erfordert angemessenes Geschick, Zeit und chirurgischen Aufwand. In Vorversuchen kann eine Dissektion oder übermäßige Stimulation der paravertebralen Bandstrukturen zur Bildung von Wirbelosteophyten führen. Es ist darauf zu achten, dass die angrenzenden Bandscheiben nicht beschädigt oder gereizt werden. Da die Eindringtiefe kontrolliert werden muss, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, haben wir manuell einen Stopfen hergestellt, indem wir die Hülle einer 3 mm langen Nadel abgeschnitten haben. Durch die Verwendung dieses Plugs wird eine gleichmäßige Bohrtiefe im Wirbelkörper gewährleistet. In vorläufigen Experimenten stellten drei an der Operation beteiligte orthopädische Chirurgen fest, dass 16-Gauge-Nadeln einfacher zu handhaben sind als 18-Gauge-Nadeln oder andere Methoden. Um eine übermäßige Blutung während des Bohrens zu vermeiden, bietet sich durch längeres Stillhalten der Nadel ein besser geeignetes Einführloch an, was darauf hindeutet, dass ein gewisser Grad an MC auf diese Weise kontrolliert werden kann.
Obwohl viele Studien auf MC abzielten, ist wenig über die Ätiologie und Pathogenese von MC25,26,27 bekannt. Basierend auf unseren früheren Studien haben wir herausgefunden, dass Autoimmunität eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und Entwicklung von MC12 spielt. Diese Studie untersuchte die quantitative Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ, die die wichtigsten Differenzierungswege von CD4+-Zellen nach Antigenstimulation sind. In unserer Studie wies die NPE-Gruppe im Vergleich zur negativen Gruppe eine höhere Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ auf, und auch die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 waren höher.
Klinisch ist die IL-17-mRNA-Expression in NP-Zellen von Patienten mit Bandscheibenvorfall erhöht28. Erhöhte IL-4- und IFN-γ-Expressionsniveaus wurden auch in einem Modell mit akutem, nicht kompressivem Bandscheibenvorfall im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen festgestellt29. IL-17 spielt eine Schlüsselrolle bei Entzündungen und Gewebeschäden bei Autoimmunerkrankungen30 und verstärkt die Immunantwort auf IFN-γ31. Bei MRL/lpr-Mäusen32 und Mäusen, die für Autoimmunität anfällig sind33, wurde über eine verstärkte IL-17-vermittelte Gewebeschädigung berichtet. IL-4 kann die Expression proinflammatorischer Zytokine (wie IL-1β und TNFα) und die Makrophagenaktivierung hemmen34. Es wurde berichtet, dass die mRNA-Expression von IL-4 in der NPE-Gruppe im Vergleich zu IL-17 und IFN-γ zum gleichen Zeitpunkt unterschiedlich war; Die mRNA-Expression von IFN-γ war in der NPE-Gruppe signifikant höher als in den anderen Gruppen. Daher kann die IFN-γ-Produktion ein Mediator der durch NP-Interkalation hervorgerufenen Entzündungsreaktion sein. Studien haben gezeigt, dass IFN-γ von mehreren Zelltypen produziert wird, darunter aktivierte Typ-1-Helfer-T-Zellen, natürliche Killerzellen und Makrophagen35,36, und ein wichtiges entzündungsförderndes Zytokin ist, das Immunreaktionen fördert37.
Diese Studie legt nahe, dass eine Autoimmunreaktion am Auftreten und der Entwicklung von MC beteiligt sein könnte. Luoma et al. fanden heraus, dass die Signaleigenschaften von MC und prominentem NP im MRT ähnlich sind und beide ein hohes Signal in der T2W-Sequenz zeigen38. Es wurde bestätigt, dass einige Zytokine eng mit dem Auftreten von MC verbunden sind, beispielsweise IL-139. Ma et al. schlugen vor, dass das Vorstehen von NP nach oben oder unten einen großen Einfluss auf das Auftreten und die Entwicklung von MC12 haben könnte. Bobechko40 und Herzbein et al.41 berichteten, dass NP ein immuntolerantes Gewebe ist, das von Geburt an nicht in den Gefäßkreislauf gelangen kann. NP-Vorsprünge bringen Fremdkörper in die Blutversorgung ein und lösen dadurch lokale Autoimmunreaktionen aus42. Autoimmunreaktionen können eine große Anzahl von Immunfaktoren induzieren, und wenn diese Faktoren kontinuierlich dem Gewebe ausgesetzt sind, können sie Veränderungen in der Signalübertragung verursachen43. In dieser Studie sind die Überexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ typische Immunfaktoren, was die enge Beziehung zwischen NP und MCs44 weiter beweist. Dieses Tiermodell ahmt den NP-Durchbruch und den Eintritt in die Endplatte gut nach. Dieser Prozess offenbarte außerdem den Einfluss der Autoimmunität auf MC.
Wie erwartet bietet uns dieses Tiermodell eine mögliche Plattform für die Untersuchung von MC. Dieses Modell weist jedoch noch einige Einschränkungen auf: Erstens müssen während der Tierbeobachtungsphase einige Kaninchen im Zwischenstadium für histologische und molekularbiologische Tests eingeschläfert werden, sodass einige Tiere mit der Zeit „nicht mehr verwendet“ werden. Zweitens: Obwohl in dieser Studie drei Zeitpunkte festgelegt wurden, haben wir leider nur einen Typ von MC (Modic-Typ-I-Änderung) modelliert, so dass dies nicht ausreicht, um den menschlichen Krankheitsentwicklungsprozess darzustellen, und es müssen mehr Zeitpunkte festgelegt werden Beobachten Sie besser alle Signaländerungen. Drittens können die Veränderungen in der Gewebestruktur zwar durch histologische Färbung deutlich dargestellt werden, einige spezielle Techniken können die mikrostrukturellen Veränderungen in diesem Modell jedoch besser sichtbar machen. Beispielsweise wurde mithilfe der Polarisationslichtmikroskopie die Bildung von Faserknorpel in den Bandscheiben von Kaninchen analysiert45. Die langfristigen Auswirkungen von NP auf MC und Endplatte erfordern weitere Untersuchungen.
Vierundfünfzig männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (Gewicht etwa 2,5–3 kg, Alter 3–3,5 Monate) wurden nach dem Zufallsprinzip in eine Scheinoperationsgruppe, eine Muskelimplantationsgruppe (ME-Gruppe) und eine Nervenwurzelimplantationsgruppe (NPE-Gruppe) eingeteilt. Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission des Tianjin-Krankenhauses genehmigt und die experimentellen Methoden wurden in strikter Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.
An der Operationstechnik von S. Sobajima 46 wurden einige Verbesserungen vorgenommen. Jedes Kaninchen wurde in eine seitliche Liegeposition gebracht und die vordere Oberfläche von fünf aufeinanderfolgenden lumbalen Bandscheiben (IVDs) wurde mithilfe eines posterolateralen retroperitonealen Zugangs freigelegt. Jedes Kaninchen erhielt eine Vollnarkose (20 % Urethan, 5 ml/kg über die Ohrvene). Von der Unterkante der Rippen bis zum Beckenrand wurde ein Hautlängsschnitt vorgenommen, 2 cm ventral der paravertebralen Muskulatur. Die rechte anterolaterale Wirbelsäule von L1 bis L6 wurde durch scharfe und stumpfe Präparation des darüber liegenden subkutanen Gewebes, retroperitonealen Gewebes und der Muskeln freigelegt (Abb. 6A). Die Bandscheibenhöhe wurde anhand des Beckenrandes als anatomischer Orientierungspunkt für die Bandscheibenhöhe L5–L6 bestimmt. Bohren Sie mit einer 16-Gauge-Punktionsnadel ein Loch in der Nähe der Endplatte des L5-Wirbels bis zu einer Tiefe von 3 mm (Abb. 6B). Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze, um den autologen Nucleus Pulposus in der Bandscheibe L1-L2 abzusaugen (Abb. 6C). Entfernen Sie den Nucleus Pulposus oder den Muskel entsprechend den Anforderungen jeder Gruppe. Nachdem das Bohrloch vertieft wurde, werden resorbierbare Nähte auf der tiefen Faszie, der oberflächlichen Faszie und der Haut angebracht, wobei darauf zu achten ist, dass das Periostgewebe des Wirbelkörpers während der Operation nicht beschädigt wird.
(A) Die Bandscheibe L5–L6 wird über einen posterolateralen retroperitonealen Zugang freigelegt. (B) Bohren Sie mit einer 16-Gauge-Nadel ein Loch in der Nähe der L5-Endplatte. (C) Autologe MFs werden geerntet.
Die Vollnarkose erfolgte mit 20 % Urethan (5 ml/kg) über die Ohrvene und die Röntgenaufnahmen der Lendenwirbelsäule wurden 12, 16 und 20 Wochen nach der Operation wiederholt.
Kaninchen wurden 12, 16 und 20 Wochen nach der Operation durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (25,0 mg/kg) und intravenösem Natriumpentobarbital (1,2 g/kg) getötet. Zur histologischen Analyse wurde die gesamte Wirbelsäule entfernt und eine echte Analyse durchgeführt. Zur Erkennung von Veränderungen der Immunfaktoren wurden quantitative Reverse Transkription (RT-qPCR) und Western Blot eingesetzt.
MRT-Untersuchungen wurden an Kaninchen unter Verwendung eines klinischen 3,0-T-Magneten (GE Medical Systems, Florence, SC) durchgeführt, der mit einem orthogonalen Gliedmaßenspulenempfänger ausgestattet war. Kaninchen wurden über die Ohrvene mit 20 % Urethan (5 ml/kg) anästhesiert und dann auf dem Rücken im Magneten platziert, wobei der Lendenbereich auf einer kreisförmigen Oberflächenspule mit 5 Zoll Durchmesser (GE Medical Systems) zentriert war. Koronale T2-gewichtete Lokalisierungsbilder (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) wurden aufgenommen, um die Position der Lendenwirbelscheibe von L3–L4 bis L5–L6 zu bestimmen. T2-gewichtete Schichten in der Sagittalebene wurden mit den folgenden Einstellungen aufgenommen: schnelle Spin-Echo-Sequenz mit einer Wiederholungszeit (TR) von 2200 ms und einer Echozeit (TE) von 70 ms, Matrix; Gesichtsfeld von 260 und acht Reizen; Die Schnittstärke betrug 2 mm, der Spalt 0,2 mm.
Nachdem das letzte Foto aufgenommen und das letzte Kaninchen getötet worden war, wurden die Schein-, Muskel- und NP-Scheiben zur histologischen Untersuchung entfernt. Die Gewebe wurden eine Woche lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, mit Ethylendiamintetraessigsäure entkalkt und Paraffinschnitte durchgeführt. Gewebeblöcke wurden in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom in sagittale Schnitte (5 μm dick) geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt.
Nach dem Sammeln der Bandscheiben von den Kaninchen in jeder Gruppe wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung einer UNIQ-10-Säule (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) gemäß den Anweisungen des Herstellers und eines ImProm II-Reverse-Transkriptionssystems (Promega Inc.) extrahiert. , Madison, WI, USA). Es wurde eine Reverse Transkription durchgeführt.
RT-qPCR wurde mit einem Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) und SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das PCR-Reaktionsvolumen betrug 20 μl und enthielt 1,5 μl verdünnte cDNA und 0,2 μM jedes Primers. Die Primer wurden von OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) entworfen und von Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) hergestellt (Tabelle 1). Die folgenden thermischen Zyklusbedingungen wurden verwendet: anfänglicher Polymerase-Aktivierungsschritt bei 94 °C für 2 Minuten, dann 40 Zyklen von jeweils 15 Sekunden bei 94 °C zur Denaturierung des Templats, Annealing für 1 Minute bei 60 °C, Verlängerung und Fluoreszenz. Die Messungen wurden 1 Minute lang bei 72 °C durchgeführt. Alle Proben wurden dreimal amplifiziert und der Durchschnittswert wurde für die RT-qPCR-Analyse verwendet. Die Amplifikationsdaten wurden mit FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) analysiert. Die Genexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ wurde auf die endogene Kontrolle (ACTB) normalisiert. Die relativen Expressionsniveaus der Ziel-mRNA wurden mithilfe der 2-ΔΔCT-Methode berechnet.
Das Gesamtprotein wurde mit einem Gewebehomogenisator in RIPA-Lysepuffer (der einen Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail enthielt) aus den Geweben extrahiert und dann 20 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 U/min zentrifugiert, um Gewebetrümmer zu entfernen. Pro Spur wurden 50 Mikrogramm Protein geladen, durch 10 % SDS-PAGE getrennt und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Blockierung wurde in 5 % fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 0,1 % Tween 20 enthielt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Membran wurde mit Kaninchen-Anti-Decorin-Primärantikörper (1:200 verdünnt; Boster, Wuhan, China) (1:200 verdünnt; Bioss, Peking, China) über Nacht bei 4 °C inkubiert und reagierte am zweiten Tag; mit sekundärem Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G in einer Verdünnung von 1:40.000) kombiniert mit Meerrettichperoxidase (Boster, Wuhan, China) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Western-Blot-Signale wurden durch erhöhte Chemilumineszenz auf der Chemilumineszenzmembran nach Röntgenbestrahlung nachgewiesen. Für die densitometrische Analyse wurden Blots mit der BandScan-Software gescannt und quantifiziert und die Ergebnisse als Verhältnis der Immunreaktivität des Zielgens zur Immunreaktivität des Tubulins ausgedrückt.
Statistische Berechnungen wurden mit dem Softwarepaket SPSS16.0 (SPSS, USA) durchgeführt. Die während der Studie gesammelten Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) ausgedrückt und mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA) analysiert, um Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu bestimmen. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Daher könnte die Etablierung eines Tiermodells für MC durch die Implantation autologer NPs in den Wirbelkörper und die Durchführung makroanatomischer Beobachtungen, MRT-Analysen, histologischer Auswertungen und molekularbiologischer Analysen ein wichtiges Instrument zur Beurteilung und zum Verständnis der Mechanismen menschlicher MC und zur Entwicklung neuer Therapeutika werden Interventionen.
Zitierweise für diesen Artikel: Han, C. et al. Ein Tiermodell für Modic-Veränderungen wurde durch die Implantation eines autologen Nucleus Pulposus in den subchondralen Knochen der Lendenwirbelsäule etabliert. Wissenschaft. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. und Boos, N. Magnetresonanztomographie der Lendenwirbelsäule: Prävalenz von Bandscheibenvorfall und -retention, Nervenwurzelkompression, Endplattenanomalien und Facettengelenk-Arthrose bei asymptomatischen Freiwilligen . Rate. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS und Leboeuf-Eed, K. Modische Veränderungen und ihre Beziehung zu klinischen Befunden. European Spine Journal: offizielle Veröffentlichung der European Spine Society, der European Society of Spinal Deformity und der European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modische Veränderungen in den Endplatten der Lendenwirbel: Prävalenz und Zusammenhang mit Schmerzen im unteren Rückenbereich und Ischias bei männlichen Arbeitern mittleren Alters. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. und Dalinka, M. MRT von Knochenmarkveränderungen in der Nähe der Endplatte bei degenerativer Erkrankung der Lendenwirbelsäule. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ und Carter, JR Degenerative Bandscheibenerkrankung: Bewertung von Veränderungen des Wirbelmarks mittels MRT. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS und Carter, JR Bildgebung degenerativer Bandscheibenerkrankungen. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Prädiktoren für Signalveränderungen der neovertebralen Endplatte (Modic) in der Allgemeinbevölkerung. European Spine Journal: Offizielle Veröffentlichung der European Spine Society, der European Society of Spinal Deformity und der European Society for Cervical Spine Research, Abteilung 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB und Mannisch, K. Modische Veränderungen nach Bandscheibenvorfall. European Spine Journal: Offizielle Veröffentlichung der European Spine Society, der European Society of Spinal Deformity und der European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. und Kaapa, E. Modische Typ-I-Veränderungen können eine schnell fortschreitende Deformation der Bandscheiben vorhersagen: eine einjährige prospektive Studie. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ und Fan, SW Modische Veränderungen: mögliche Ursachen und Beitrag zur Bandscheibendegeneration im Lendenbereich. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Interner Bandscheibenriss. Bandscheibenvorfallprobleme über 50 Jahre. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 13. Dezember 2024