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Die Einrichtung von Tiermodellen für modische Veränderungen (MC) ist eine wichtige Grundlage für die Untersuchung von MC. Vierundfünfundfünfzig neue Kaninchen der neuen Zealand wurden in die Schamoperationsgruppe, die Muskelimplantationsgruppe (ME-Gruppe) und die Nucleus-Pulposus-Implantationsgruppe (NPE-Gruppe) unterteilt. In der NPE -Gruppe wurde die Bandscheibe durch den anterolateralen lumbalen chirurgischen Ansatz freigelegt, und eine Nadel wurde verwendet, um den L5 -Wirbelkörper nahe der Endplatte zu durchsuchen. NP wurde von der L1/2 -Bandscheibe durch eine Spritze extrahiert und in sie injiziert. Ein Loch in den subchondralen Knochen bohren. Die chirurgischen Eingriffe und Bohrmethoden in der Muskelimplantationsgruppe und der Schamoperationsgruppe waren die gleichen wie in der NP-Implantationsgruppe. In der ME-Gruppe wurde ein Stück Muskeln in das Loch gelegt, während in der Schamoperationsgruppe nichts in das Loch gelegt wurde. Nach dem Betrieb wurden MRT -Scan- und molekulare biologische Tests durchgeführt. Das Signal in der NPE-Gruppe änderte sich, aber es gab keine offensichtliche Signaländerung in der Schamoperationsgruppe und der ME-Gruppe. Die histologische Beobachtung zeigte, dass an der Implantationsstelle eine abnormale Gewebeproliferation beobachtet wurde, und die Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ war in der NPE-Gruppe erhöht. Die Implantation von NP in den subchondralen Knochen kann ein Tiermodell von MC bilden.
Modische Veränderungen (MC) sind Läsionen der Wirbel -Endplatten und benachbartes Knochenmark, das auf der Magnetresonanztomographie (MRT) sichtbar ist. Sie sind bei Personen mit assoziierten Symptomen weit verbreitet. Viele Studien haben die Bedeutung von MC aufgrund seines Zusammenhangs mit Low -Rückenschmerzen (LBP) 2,3 betont. De Roos et al.4 und Modic et al.5 beschrieben zuerst drei verschiedene Arten von subchondralen Signalanomalien im Wirbelknochenmark. Modische Veränderungen vom Typ I sind in T1-gewichteten (T1W) -Sequenzen und hyperintens in T2-gewichteten (T2W) Sequenzen hypointensiv. Diese Läsion zeigt Fissurendplatten und angrenzende Gefäßkörnungsgewebe im Knochenmark. Modische Änderungen vom Typ II zeigen ein hohes Signal sowohl für T1W- als auch für T2W -Sequenzen. In dieser Art der Läsion kann die Zerstörung von Endplatten sowie der histologische Fettersatz des angrenzenden Knochenmarks gefunden werden. Modische Änderungen vom Typ III zeigen ein niedriges Signal in T1W- und T2W -Sequenzen. Sklerotische Läsionen, die den Endplatten entsprechen, wurden beobachtet6. MC wird als pathologische Erkrankung der Wirbelsäule angesehen und ist eng mit vielen degenerativen Erkrankungen der Wirbelsäule 7,8,9 verbunden.
In Anbetracht der verfügbaren Daten haben mehrere Studien detaillierte Einblicke in die Ätiologie und die pathologischen Mechanismen von MC geliefert. Albert et al. schlug vor, dass MC durch Disc -Herniation verursacht werden kann8. Hu et al. zu einer schweren Disc -Degeneration 10 zugeschrieben. KROC schlug das Konzept der „internen Scheibenruptur“ vor, die besagt, dass sich wiederholtes Disc -Trauma in der Endplatte zu Mikrotears führen kann. Nach der Bildung von Spalten kann die Zerstörung von Endplatten durch den Nucleus pulposus (NP) eine Autoimmunantwort auslösen, die weiter zur Entwicklung von MC11 führt. Ma et al. teilte eine ähnliche Ansicht und berichtete, dass die NP-induzierte Autoimmunität eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von MC12 spielt.
Immunsystemzellen, insbesondere CD4+ T -Helferlymphozyten, spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Autoimmunität13. Die kürzlich entdeckte Th17-Untergruppe erzeugt das proinflammatorische Cytokin IL-17, fördert die Chemokinexpression und stimuliert T-Zellen in beschädigten Organen, um IFN-γ14 zu produzieren. Th2 -Zellen spielen auch eine einzigartige Rolle bei der Pathogenese von Immunantworten. Die Expression von IL-4 als repräsentative Th2-Zelle kann zu schweren immunopathologischen Folgen führen15.
Obwohl viele klinische Studien auf MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 durchgeführt wurden Wird verwendet, um die Ätiologie oder neue Behandlungen wie gezielte Therapie zu untersuchen. Bisher wurde berichtet, dass nur wenige Tiermodelle von MC die zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen untersuchen.
Basierend auf der von Albert und MA vorgeschlagenen Autoimmuntheorie bildete diese Studie ein einfaches und reproduzierbares Kaninchen -MC -Modell durch autotransplantierende NP in der Nähe der gebohrten Wirbel -Endplatte. Andere Ziele sind es, die histologischen Eigenschaften der Tiermodelle zu beobachten und die spezifischen Mechanismen von NP bei der Entwicklung von MC zu bewerten. Zu diesem Zweck verwenden wir Techniken wie molekulare Biologie, MRT und histologische Studien, um das Fortschreiten von MC zu untersuchen.
Während der Operation starben zwei Kaninchen an Blutungen, und während der MRT starben vier Kaninchen während der Anästhesie. Die verbleibenden 48 Kaninchen überlebten und zeigten nach der Operation keine Verhaltens- oder neurologischen Anzeichen.
Die MRT zeigt, dass die Signalintensität des eingebetteten Gewebes in verschiedenen Löchern unterschiedlich ist. Die Signalintensität des L5 -Wirbelkörpers in der NPE -Gruppe änderte sich nach 12, 16 und 20 Wochen nach Insertion (T1W -Sequenz zeigte ein niedriges Signal, und die T2W -Sequenz zeigte ein gemischtes Signal plus niedriges Signal) (Abb. 1C), während die MRT -Auftritte auftraten Von den beiden anderen Gruppen eingebetteter Teile blieben im gleichen Zeitraum relativ stabil (Abb. 1a, b).
(A) Repräsentative sequentielle MRIS der Kaninchenlumbalwirbelsäule zu 3 Zeitpunkten. In den Bildern der Scheinoperationsgruppe wurden keine Signalanomalien gefunden. (B) Die Signalmerkmale des Wirbelkörpers in der ME-Gruppe ähneln denen in der Schamoperationsgruppe, und an der Einbettungsstelle im Laufe der Zeit wird keine signifikante Signaländerung beobachtet. (C) In der NPE -Gruppe ist das niedrige Signal in der T1W -Sequenz deutlich sichtbar, und das gemischte Signal und das niedrige Signal sind in der T2W -Sequenz eindeutig sichtbar. Von der 12-wöchigen Zeit bis zum 20-wöchigen Zeitraum nehmen die sporadischen hohen Signale, die die niedrigen Signale in der T2W-Sequenz umgeben, ab.
An der Implantationsstelle des Wirbelkörpers in der NPE -Gruppe kann offensichtliche Knochenhyperplasie beobachtet werden, und die Knochenhyperplasie tritt im Vergleich zur NPE -Gruppe schneller von 12 bis 20 Wochen auf Körper; Sham Group und ME Group (Abb. 2C) 2a, b).
(A) Die Oberfläche des Wirbelkörpers am implantierten Teil ist sehr glatt, das Loch heilt gut und es gibt keine Hyperplasie im Wirbelkörper. (B) Die Form der implantierten Stelle in der ME -Gruppe ähnelt der in der Scheinbetriebsgruppe, und es gibt keine offensichtliche Änderung des Erscheinungsbilds der implantierten Stelle im Laufe der Zeit. (C) Knochenhyperplasie trat an der implantierten Stelle in der NPE -Gruppe auf. Die Knochenhyperplasie nahm schnell zu und erstreckte sich sogar durch die Bandscheibe auf den kontralateralen Wirbelkörper.
Die histologische Analyse liefert detailliertere Informationen zur Knochenbildung. Abbildung 3 zeigt die Fotos der mit H & E gefärbten postoperativen Abschnitte. In der Scheinoperationsgruppe waren die Chondrozyten gut angeordnet und es wurde keine Zellproliferation festgestellt (Fig. 3a). Die Situation in der ME-Gruppe ähnelte der in der Schamoperationsgruppe (Abb. 3b). In der NPE-Gruppe wurden jedoch an der Implantationsstelle eine große Anzahl von Chondrozyten und die Proliferation von NP-ähnlichen Zellen beobachtet (3C);
(A) Trabekel sind in der Nähe der Endplatte zu sehen, die Chondrozyten sind ordentlich mit gleichmäßiger Zellgröße und -form und ohne Proliferation (40 -mal) angeordnet. (B) Der Zustand der Implantationsstelle in der ME -Gruppe ähnelt der der Scheingruppe. Trabeculae und Chondrozyten sind zu sehen, aber es gibt keine offensichtliche Proliferation an der Implantationsstelle (40 -mal). (B) Es ist ersichtlich, dass sich Chondrozyten und NP-ähnliche Zellen signifikant vermehren, und die Form und Größe von Chondrozyten sind ungleichmäßig (40 Mal).
Die Expression von Interleukin 4 (IL-4) mRNA, Interleukin 17 (IL-17) -MRNA und Interferon γ (IFN-γ) -MRNA wurde sowohl in der NPE- als auch in ME-Gruppen beobachtet. Wenn die Expressionsniveaus der Zielgene verglichen wurden, waren die Genexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe im Vergleich zu denen der ME-Gruppe und der Scheinbetriebsgruppe signifikant erhöht (4) (P <0,05). Im Vergleich zur Scheinbetriebsgruppe nahmen die Expressionsniveaus von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der ME-Gruppe nur geringfügig zu und erreichten keine statistische Veränderung (P> 0,05).
Die mRNA-Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ in der NPE-Gruppe zeigte einen signifikant höheren Trend als die in der Scheinbetriebsgruppe und in der ME-Gruppe (P <0,05).
Im Gegensatz dazu zeigten die Expressionsniveaus in der ME -Gruppe keinen signifikanten Unterschied (p> 0,05).
Die Western-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen IL-4 und IL-17 durchgeführt, um das veränderte mRNA-Expressionsmuster zu bestätigen. Wie in 5A, B, im Vergleich zur ME-Gruppe und der Scheinbetriebsgruppe gezeigt, waren die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der NPE-Gruppe signifikant erhöht (p <0,05). Im Vergleich zur Scheinbetriebsgruppe konnten die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der ME-Gruppe statistisch signifikante Änderungen nicht erreichen (p> 0,05).
(A) Die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 in der NPE-Gruppe waren signifikant höher als in der ME-Gruppe und in der Placebo-Gruppe (p <0,05). (B) Western Blot -Histogramm.
Aufgrund der begrenzten Anzahl menschlicher Proben, die während der Operation erhalten wurden, sind klare und detaillierte Studien zur Pathogenese von MC etwas schwierig. Wir haben versucht, ein Tiermodell von MC zu etablieren, um seine potenziellen pathologischen Mechanismen zu untersuchen. Gleichzeitig wurden radiologische Bewertung, histologische Bewertung und molekulare biologische Bewertung verwendet, um dem durch NP -Autotransplantat induzierten MC -Verlauf zu folgen. Infolgedessen führte das NP-Implantationsmodell zu einer allmählichen Änderung der Signalintensität von 12 Wochen bis 20 Wochen Zeitpunkten (gemischtes niedriges Signal in T1W-Sequenzen und niedrigem Signal in T2W Biologische Bewertungen bestätigten die Ergebnisse der radiologischen Studie.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass an der Stelle der Wirbelkörperverletzung in der NPE -Gruppe visuelle und histologische Veränderungen auftraten. Gleichzeitig wurde die Expression von IL-4-, IL-17- und IFN-γ-Genen sowie IL-4, IL-17 und IFN-γ beobachtet, was darauf hinweist Der Körper kann eine Reihe von Signal- und morphologischen Veränderungen verursachen. Es ist leicht zu ermitteln, dass die Signaleigenschaften der Wirbelkörper des Tiermodells (niedriges Signal in der T1W -Sequenz, gemischtes Signal und niedrigem Signal in der T2W Bestätigen Sie die Beobachtungen der Histologie und der Bruttoanatomie, dh die Veränderungen in den Wirbelkörperzellen sind progressiv. Obwohl die durch akute Trauma verursachte Entzündungsreaktion kurz nach der Pünktung auftreten kann, zeigten die MRT -Ergebnisse, dass zunehmende Signaländerungen 12 Wochen nach der Pünktung auftraten und bis zu 20 Wochen ohne Anzeichen einer Erholung oder Umkehrung der MRT -Veränderungen bestanden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der autologe Wirbel -NP eine zuverlässige Methode zur Einrichtung progressiver MV bei Kaninchen ist.
Dieses Punktionsmodell erfordert angemessene Fähigkeiten, Zeit und chirurgische Anstrengung. In vorläufigen Experimenten können die Dissektion oder eine übermäßige Stimulation der paravertebralen Bandstrukturen zur Bildung von Wirbelosteophyten führen. Es sollte darauf geachtet werden, die angrenzenden Scheiben nicht zu beschädigen oder zu irritieren. Da die Tiefe der Penetration kontrolliert werden muss, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, haben wir einen Stecker manuell gemacht, indem wir die Hülle einer 3 mm langen Nadel abschneiden. Die Verwendung dieses Steckers sorgt für eine gleichmäßige Bohrtiefe im Wirbelkörper. In vorläufigen Experimenten fanden drei an der Operation beteiligte orthopädische Chirurgen 16-Gauge-Nadeln leichter als 18-Gauge-Nadeln oder andere Methoden. Um übermäßige Blutungen beim Bohren zu vermeiden, bietet das Halten der Nadel eine Weile immer noch ein geeigneteres Insertionsloch, was darauf hindeutet, dass ein gewisses Maß an MC auf diese Weise kontrolliert werden kann.
Obwohl viele Studien MC ins Visier genommen haben, ist wenig über die Ätiologie und Pathogenese von MC25, 26, 27 bekannt. Basierend auf unseren früheren Studien fanden wir heraus, dass die Autoimmunität eine Schlüsselrolle beim Auftreten und der Entwicklung von MC12 spielt. Diese Studie untersuchte die quantitative Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ, die nach Antigenstimulation die Hauptdifferenzierungswege von CD4+ -Zellen sind. In unserer Studie hatte die NPE-Gruppe im Vergleich zur negativen Gruppe eine höhere Expression von IL-4, IL-17 und IFN-γ, und die Proteinspiegel von IL-4 und IL-17 waren ebenfalls höher.
Klinisch ist die IL-17-mRNA-Expression in NP-Zellen von Patienten mit Scheibenvorfallzeit erhöht28. Erhöhte IL-4- und IFN-γ-Expressionsniveaus wurden auch in einem akuten nicht kompressiven Scheibenvorfallmodell im Vergleich zu gesunden Kontrollen 29 gefunden. IL-17 spielt eine Schlüsselrolle bei Entzündungen, Gewebeverletzungen bei Autoimmunerkrankungen30 und verbessert die Immunantwort auf IFN-γ31. In MRL/LPR MICE32 und Autoimmunitäts-saftempfindlichem MICE33 wurde über eine verbesserte IL-17-vermittelte Gewebeverletzung berichtet. IL-4 kann die Expression von proinflammatorischen Zytokinen (wie IL-1β und TNFα) und Makrophagenaktivierung34 hemmen. Es wurde berichtet, dass die mRNA-Expression von IL-4 in der NPE-Gruppe im Vergleich zu IL-17 und IFN-γ zum gleichen Zeitpunkt unterschiedlich war; Die mRNA-Expression von IFN-γ in der NPE-Gruppe war signifikant höher als in den anderen Gruppen. Daher kann die IFN-γ-Produktion ein Mediator der durch NP-Interkalation induzierten Entzündungsreaktion sein. Studien haben gezeigt, dass IFN-γ von mehreren Zelltypen produziert wird, einschließlich aktivierter Typ-1-Helfer-T-Zellen, natürlichen Killerzellen und Makrophagen35,36, und ein wichtiger proinflammatorischer Zytokin ist, das die Immunantworten fördert37.
Diese Studie legt nahe, dass die Autoimmunreaktion am Auftreten und zur Entwicklung von MC beteiligt sein kann. Luoma et al. fanden heraus, dass die Signalmerkmale von MC und prominenter NP bei der MRT ähnlich sind und beide in T2W Sequence38 ein hohes Signal zeigen. Es wurde bestätigt, dass einige Zytokine eng mit dem Auftreten von MC wie IL-139 verbunden sind. Ma et al. schlug vor, dass der Aufwärts- oder Abwärtsvorrat von NP einen großen Einfluss auf das Auftreten und die Entwicklung von MC12 haben kann. Bobechko40 und Herzbein et al.41 berichteten, dass NP ein immuntolerantes Gewebe ist, das von der Geburt nicht in die Gefäßkreislauf gelangen kann. NP -Voraussetzungen führen Fremdkörper in die Blutversorgung ein und vermitteln dadurch lokale Autoimmunreaktionen42. Autoimmunreaktionen können eine große Anzahl von Immunfaktoren induzieren, und wenn diese Faktoren kontinuierlich Geweben ausgesetzt sind, können sie Änderungen der Signalübertragung verursachen43. In dieser Studie sind die Überexpression von IL-4, IL-17 und IFN-γ typische Immunfaktoren, was die enge Beziehung zwischen NP und MCS44 weiter belegt. Dieses Tiermodell ahmt den NP -Durchbruch und den Eintritt in die Endplatte gut nach. Dieser Prozess ergab weiter die Auswirkungen der Autoimmunität auf MC.
Wie erwartet bietet uns dieses Tiermodell eine mögliche Plattform, um MC zu untersuchen. Dieses Modell hat jedoch immer noch einige Einschränkungen: Zunächst müssen einige Kaninchen der tierischen Beobachtung für histologische und molekulare Biologie-Tests eingeschläfert werden, sodass einige Tiere im Laufe der Zeit „aus dem Gebrauch nicht mehr ausgebraucht“ werden. Zweitens haben wir, obwohl in dieser Studie drei Zeitpunkte festgelegt sind, leider nur eine Art von MC (modische Typ -I -Veränderung) modelliert, so Beobachten Sie besser alle Signaländerungen. Drittens können die Veränderungen der Gewebestruktur tatsächlich durch histologische Färbung deutlich gezeigt werden, aber einige spezialisierte Techniken können die mikrostrukturellen Veränderungen in diesem Modell besser aufzeigen. Beispielsweise wurde eine polarisierte Lichtmikroskopie verwendet, um die Bildung von Fibrocartilage in Kaninchen -Bandscheiben45 zu analysieren. Die langfristigen Auswirkungen von NP auf MC und Endplatte erfordern weitere Untersuchungen.
Vierundfünfzig männliche Neuseeland weiße Kaninchen (Gewicht von etwa 2,5 bis 3 kg, Alter von 3 bis 3,5 Monaten) wurden zufällig in die Scheinbetriebsgruppe, die Muskelimplantationsgruppe (ME-Gruppe) und die Nervenwurzelimplantationsgruppe (NPE-Gruppe) unterteilt. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Ethikkommission des Tianjin Hospital genehmigt, und die experimentellen Methoden wurden in strenger Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.
Einige Verbesserungen wurden an der chirurgischen Technik von S. Sobajima 46 vorgenommen. Jedes Kaninchen wurde in eine laterale Liegeposition gebracht und die vordere Oberfläche von fünf aufeinanderfolgenden lumbalen Bandscheiben (IVDS) wurde unter Verwendung eines posterolateralen retroperitonealen Ansatzes freigelegt. Jedes Kaninchen erhielt eine Vollnarkose (20% Urethan, 5 ml/kg über die Ohrvene). Ein Längsschnitt -Hautschnitt wurde von der unteren Rand der Rippen bis zum Beckenkrempe, 2 cm ventral zur paravertebralen Muskeln, hergestellt. Die rechte anterolaterale Wirbelsäule von L1 bis L6 wurde durch scharfe und stumpfe Dissektion des darüber liegenden subkutanen Gewebes, retroperitoneales Gewebe und Muskeln ausgesetzt (Abb. 6a). Der Scheibenspiegel wurde unter Verwendung des Beckenkrempelns als anatomischer Wahrzeichen für den L5-L6-Scheibenebene bestimmt. Verwenden Sie eine 16-Gauge-Punktionsnadel, um ein Loch in der Nähe der Endplatte des L5-Wirbels bis zu einer Tiefe von 3 mm zu bohren (Abb. 6b). Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze, um den autologen Kernpulposus in der L1-L2-Bandscheibe zu aspirieren (Fig. 6C). Entfernen Sie den Kernpulposus oder den Muskel gemäß den Anforderungen jeder Gruppe. Nachdem das Bohrloch vertieft wurde, werden absorbierbare Nähte auf die tiefe Faszie, die oberflächliche Faszie und die Haut gelegt, wobei darauf geachtet wird, dass das periostale Gewebe des Wirbelkörpers während der Operation nicht beschädigt wird.
(A) Die L5 -L6 -Scheibe wird über einen posterolateralen retroperitonealen Ansatz freigelegt. (B) Verwenden Sie eine 16-Gauge-Nadel, um ein Loch in der Nähe der L5-Endplatte zu bohren. (C) Autologe MFs werden geerntet.
Eine Vollnarkose wurde mit 20% Urethan (5 ml/kg) über die Ohrvene verabreicht, und die Röntgenaufnahmen der Lendenwirbelsäule wurden 12, 16 und 20 Wochen nach der Operation wiederholt.
Kaninchen wurden durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (25,0 mg/kg) und intravenösem Natriumpentobarbital (1,2 g/kg) 12, 16 und 20 Wochen nach der Operation geopfert. Die gesamte Wirbelsäule wurde für die histologische Analyse entfernt und eine reale Analyse wurde durchgeführt. Quantitative Reverse-Transkription (RT-qPCR) und Western Blot wurden verwendet, um Änderungen der Immunfaktoren zu erkennen.
MRT -Untersuchungen wurden bei Kaninchen unter Verwendung eines 3,0 T -klinischen Magneten (GE Medical Systems, Florence, SC) durchgeführt, der mit einem orthogonalen Extremitätsempfänger ausgestattet war. Kaninchen wurden mit 20% Urethan (5 ml/kg) über die Ohrvene anästhesiert und dann Rückenlage in den Magneten mit dem Lendenbereich auf einer kreisförmigen Oberflächenspule mit 5-Zoll-Durchmesser (GE Medical Systems) platziert. Koronale T2-gewichtete Lokalisiererbilder (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) wurden aufgenommen, um den Ort der Lumbalscheibe von L3-L4 bis L5-L6 zu definieren. Die T2-gewichteten Sagittalebene wurden mit den folgenden Einstellungen erfasst: schnelle Spin-Echo-Sequenz mit einer Wiederholungszeit (TR) von 2200 ms und einer Echo-Zeit (TE) von 70 ms, Matrix; Gesichtsfeld von 260 und acht Stimuli; Die Schneiddicke betrug 2 mm, die Lücke betrug 0,2 mm.
Nachdem das letzte Foto aufgenommen wurde und das letzte Kaninchen getötet wurde, wurden die Schein-, Muskel-Einbetten- und NP-Scheiben zur histologischen Untersuchung entfernt. Die Gewebe wurden 1 Woche lang in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, mit Ethylendiaminetetraessigsäure und Paraffin geschnitten. Gewebeblöcke wurden in Paraffin eingebettet und unter Verwendung eines Mikrotoms in sagittale Schnitte (5 & mgr; m dick) geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt.
Nach dem Sammeln der Bandscheiben aus den Kaninchen in jeder Gruppe wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung einer UNIQ-10-Säule (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) gemäß den Anweisungen des Herstellers und einem Improm II Reverse-Transkriptionssystem (Promega Inc. , Madison, WI, USA). Reverse Transkription wurde durchgeführt.
RT-QPCR wurde unter Verwendung eines Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) und SYBR Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das PCR -Reaktionsvolumen betrug 20 & mgr; l und enthielt 1,5 & mgr; l verdünntes cDNA und 0,2 & mgr; m für jeden Primer. Die Primer wurden von Oligoperfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) entworfen und von Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) hergestellt (Tabelle 1). Die folgenden thermischen Zyklusbedingungen wurden verwendet: anfängliche Polymeraseaktivierungsschritt bei 94 ° C für 2 Minuten, dann 40 Zyklen von jeweils 15 s bei 94 ° C zur Vorlagen -Denaturierung, 1 min bei 60 ° C, Ausdehnung und Fluoreszenz. Die Messungen wurden 1 min bei 72 ° C durchgeführt. Alle Proben wurden dreimal amplifiziert und der Durchschnittswert wurde für die RT-qPCR-Analyse verwendet. Amplifikationsdaten wurden unter Verwendung von FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) analysiert. IL-4, IL-17 und IFN-γ-Genexpression wurden auf die endogene Kontrolle (ACTB) normalisiert. Die relativen Expressionsniveaus von Ziel-mRNA wurden unter Verwendung der 2-ΔδCT-Methode berechnet.
Das Gesamtprotein wurde aus Geweben unter Verwendung eines Gewebehomogenisators im RIPA -Lyse -Puffer (mit einem Cocktail von Protease und Phosphatase -Inhibitor) extrahiert und dann 20 min bei 4 ° C bei 13.000 U / min zentrifugiert, um Gewebegrad zu entfernen. Fünfzig Mikrogramm Protein wurden pro Fahrspur geladen, durch 10% SDS-PAGE getrennt und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Blockierung wurde in 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1% Tween 20 für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Membran wurde mit einem primären Antikörper gegen Kaninchen-Anti-Decorin (verdünnt 1: 200; Boster, Wuhan, China) (verdünnt 1: 200; Bioss, Peking, China) über Nacht bei 4 ° C und reagierte an den zweiten Tagen; mit sekundärem Antikörper (Ziegen Anti-Kaninchen-Immunglobulin G bei 1: 40.000 Verdünnung) in Kombination mit Meerrettichperoxidase (Boster, Wuhan, China) 1 Stunde bei Raumtemperatur. Western-Blot-Signale wurden durch eine erhöhte Chemilumineszenz an der Chemilumineszenzmembran nach Röntgenbestrahlung nachgewiesen. Für die densitometrische Analyse wurden die Blots unter Verwendung einer Bandscan -Software gescannt und quantifiziert, und die Ergebnisse wurden als Verhältnis der Immunreaktivität der Zielgen zur Tubulin -Immunreaktivität ausgedrückt.
Statistische Berechnungen wurden unter Verwendung des SPSS16.0 -Softwarepakets (SPSS, USA) durchgeführt. Die während der Studie erfassten Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) ausgedrückt und unter Verwendung einer Varianzanalyse der Einweg-wiederholten Messungen (ANOVA) analysiert, um die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu bestimmen. P <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Daher kann die Etablierung eines Tiermodells von MC durch Implantation autologer NPs in den Wirbelkörper und die Durchführung makroanatomischer Beobachtung, MRT Interventionen.
Wie man diesen Artikel zitiert: Han, C. et al. Ein Tiermodell für modische Veränderungen wurde durch Implantieren autologer Kernpulposus in den subchondralen Knochen der Lendenwirbelsäule festgelegt. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
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Postzeit: Dec-13-2024