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Mikrobielles Wachstum in Wunden manifestiert sich häufig in Form von Biofilmen, die die Heilung beeinträchtigen und schwer zu entfernen sind. Neuartige Silberverbände versprechen die Bekämpfung von Wundinfektionen, ihre Wirksamkeit gegen Biofilme und ihre infektionsunabhängigen Heilungseffekte sind jedoch weitgehend unbekannt. Anhand von In-vitro- und In-vivo-Biofilmmodellen von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa berichten wir über die Wirksamkeit von Ag1+-Ionen-generierenden Verbänden: Ag1+-Verbände mit Ethylendiamintetraessigsäure und Benzethoniumchlorid (Ag1+/EDTA/BC) sowie Verbände mit Silbernitrat (Ag-Oxysalze). Diese Verbände produzieren Ag1+-, Ag2+- und Ag3+-Ionen, um Wundbiofilme zu bekämpfen und deren Einfluss auf die Heilung zu untersuchen. Ag1+-Verbände zeigten in vitro und in Mäusen (C57BL/6j) nur minimale Auswirkungen auf Wundbiofilme. Im Gegensatz dazu reduzierten oxygenierte Ag-Salze und Ag1+/EDTA/BC-Verbände die Anzahl lebensfähiger Bakterien in Biofilmen in vitro signifikant und zeigten eine signifikante Reduktion bakterieller und EPS-Komponenten in Wundbiofilmen von Mäusen. Diese Verbände hatten unterschiedliche Auswirkungen auf die Heilung von Biofilm-infizierten und nicht-Biofilm-infizierten Wunden. Oxygenierte Salzverbände zeigten dabei im Vergleich zu Kontrollbehandlungen und anderen Silberverbänden positive Effekte auf die Reepithelisierung, die Wundgröße und die Entzündung. Die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften von Silberverbänden können unterschiedliche Auswirkungen auf Wundbiofilme und die Wundheilung haben. Dies sollte bei der Auswahl eines Verbandes zur Behandlung von Biofilm-infizierten Wunden berücksichtigt werden.
Chronische Wunden werden definiert als „Wunden, die die normalen Heilungsphasen nicht geordnet und zeitgerecht durchlaufen“1. Sie stellen eine psychische, soziale und wirtschaftliche Belastung für Patienten und das Gesundheitssystem dar. Die jährlichen Ausgaben des britischen National Health Service (NHS) für die Behandlung von Wunden und damit verbundenen Begleiterkrankungen wurden für den Zeitraum 2017–2018 auf 8,3 Milliarden Pfund Sterling geschätzt2. Auch in den Vereinigten Staaten stellen chronische Wunden derzeit ein dringendes Problem dar. Medicare schätzt die jährlichen Behandlungskosten für Patienten mit Wunden auf 28,1 bis 96,8 Milliarden US-Dollar3.
Infektionen sind ein wesentlicher Faktor, der die Wundheilung hemmt. Sie manifestieren sich häufig in Form von Biofilmen, die in 78 % der nicht heilenden chronischen Wunden nachweisbar sind. Biofilme entstehen, wenn sich Mikroorganismen irreversibel an Oberflächen wie Wundflächen anheften und zu extrazellulären Polymeren (EPS) produzierenden Gemeinschaften aggregieren können. Wundbiofilme sind mit einer verstärkten Entzündungsreaktion verbunden, die zu Gewebeschäden führt und die Heilung verzögern oder verhindern kann⁴. Die Zunahme der Gewebeschäden kann teilweise auf eine erhöhte Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen, Kollagenase, Elastase und reaktiven Sauerstoffspezies zurückzuführen sein⁵. Darüber hinaus verbrauchen Entzündungszellen und Biofilme selbst große Mengen Sauerstoff und können daher eine lokale Gewebehypoxie verursachen, wodurch den Zellen der für eine effektive Gewebereparatur lebenswichtige Sauerstoff entzogen wird⁶.
Ausgereifte Biofilme sind hochresistent gegenüber antimikrobiellen Substanzen, weshalb aggressive Strategien zur Bekämpfung von Biofilminfektionen erforderlich sind, wie beispielsweise eine mechanische Entfernung gefolgt von einer wirksamen antimikrobiellen Therapie. Da sich Biofilme schnell regenerieren können, können wirksame antimikrobielle Mittel das Risiko einer erneuten Bildung nach chirurgischem Débridement verringern.7
Silber wird zunehmend in antimikrobiellen Wundauflagen eingesetzt und dient oft als Erstlinientherapie bei chronisch infizierten Wunden. Es gibt zahlreiche handelsübliche Silberverbände, die sich in Zusammensetzung, Konzentration und Basismatrix des Silbers unterscheiden. Fortschritte bei Silberarmbändern haben zur Entwicklung neuer Silberarmbänder geführt. Metallisches Silber (Ag⁰) ist inert; um antimikrobiell wirksam zu sein, muss es ein Elektron abgeben und ionisches Silber (Ag⁺) bilden. Traditionelle Silberverbände enthalten Silberverbindungen oder metallisches Silber, die sich bei Kontakt mit Flüssigkeit zersetzen und Ag⁺-Ionen bilden. Diese Ag⁺-Ionen reagieren mit der Bakterienzelle und entziehen ihr Elektronen aus Strukturkomponenten oder für lebenswichtige Prozesse notwendigen Prozessen. Patentierte Technologie hat zur Entwicklung einer neuen Silberverbindung, der Silberoxysalze (Silbernitrat, Ag₇NO₁₁), geführt, die in Wundverbänden enthalten ist. Im Gegensatz zu herkömmlichem Silber entstehen bei der Zersetzung sauerstoffhaltiger Salze Silberionen mit höherer Wertigkeit (Ag⁺, Ag²⁺ und Ag³⁺). In-vitro-Studien haben gezeigt, dass niedrige Konzentrationen oxygenierter Silbersalze wirksamer gegen pathogene Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Escherichia coli sind als monoionisches Silber (Ag1+)8,9. Ein weiterer neuartiger Silberverband enthält zusätzliche Inhaltsstoffe, nämlich Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Benzethoniumchlorid (BC), die gezielt die extrazelluläre polymere Substanz (EPS) des Biofilms angreifen und dadurch das Eindringen von Silber in den Biofilm verbessern sollen. Diese neuen Silbertechnologien bieten neue Möglichkeiten zur Behandlung von Wundbiofilmen. Es ist jedoch wichtig, die Auswirkungen dieser antimikrobiellen Substanzen auf das Wundmilieu und die infektionsunabhängige Wundheilung zu untersuchen, um sicherzustellen, dass sie kein ungünstiges Wundmilieu schaffen oder die Heilung verzögern. Bedenken hinsichtlich der Zytotoxizität von Silber in vitro wurden bei verschiedenen Silberverbänden geäußert10,11. Bisher hat sich die Zytotoxizität in vitro jedoch nicht in eine Toxizität in vivo übertragen, und mehrere Ag1+-Verbände haben ein gutes Sicherheitsprofil gezeigt12.
In dieser Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von Carboxymethylcellulose-Wundauflagen mit neuartigen Silberformulierungen gegen Wundbiofilm in vitro und in vivo. Zusätzlich wurden die Auswirkungen dieser Wundauflagen auf Immunreaktionen und die Wundheilung unabhängig von einer Infektion bewertet.
Alle verwendeten Wundauflagen waren handelsüblich. Die 3M Kerracel Gel-Faser-Wundauflage (3M, Knutsford, UK) ist eine nicht-antimikrobielle Gel-Faser-Wundauflage aus 100 % Carboxymethylcellulose (CMC) und diente in dieser Studie als Kontrollverband. Drei antimikrobielle CMC-Silber-Wundauflagen wurden untersucht, darunter die 3M Kerracel Ag-Wundauflage (3M, Knutsford, UK), die 1,7 Gew.-% oxygeniertes Silbersalz (Ag₇NO₁₁) in Form von höherwertigen Silberionen (Ag⁺, Ag²⁺ und Ag³⁺) enthält. Bei der Zersetzung von Ag₇NO₁₁ entstehen Ag⁺-, Ag²⁺- und Ag³⁺-Ionen im Verhältnis 1:2:4. Aquacel Ag Extra Wundauflage mit 1,2 % Silberchlorid (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, UK) 13 und Aquacel Ag + Extra Wundauflage mit 1,2 % Silberchlorid (Ag1+), EDTA und Benzethoniumchlorid (ConvaTec, Deeside, UK) 14.
Bei den in dieser Studie verwendeten Stämmen handelte es sich um Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) und Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterien wurden über Nacht in Müller-Hinton-Bouillon (Oxoid, Altrincham, UK) angezüchtet. Die Übernachtkultur wurde anschließend 1:100 in Müller-Hinton-Bouillon verdünnt und 200 µl davon auf sterile 0,2 µm Whatman-Cyclopore-Membranen (Whatman plc, Maidstone, UK) auf Müller-Hinton-Agarplatten (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Großbritannien) ausplattiert. Die Bildung kolonialer Biofilme erfolgte 24 Stunden lang bei 37 °C. Die kolonialen Biofilme wurden auf logarithmische Schrumpfung untersucht.
Schneiden Sie den Verband in 3 cm² große Quadrate und befeuchten Sie ihn mit sterilem, deionisiertem Wasser. Legen Sie den Verband auf den Biofilm der Kolonie auf der Agarplatte. Alle 24 ha wurde Biofilm entnommen und die Anzahl der lebensfähigen Bakterien im Biofilm (KBE/ml) mittels Verdünnungsreihe (10⁻¹ bis 10⁻⁷) in Day-Angle-Neutralisationsbouillon (Merck-Millipore) bestimmt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C wurden Standard-Plattenzählungen auf Mueller-Hinton-Agarplatten durchgeführt. Jede Behandlung und jeder Zeitpunkt wurde dreifach durchgeführt, und die Plattenzählungen wurden für jede Verdünnung wiederholt.
Die Schwarte des Schweinebauchs wurde innerhalb von 15 Minuten nach der Schlachtung von weiblichen Large White-Schweinen gemäß den Exportstandards der Europäischen Union gewonnen. Die Schwarte wurde abgeschabt, mit Alkoholtüchern gereinigt und anschließend 24 Stunden lang bei -80 °C eingefroren, um sie zu devitalisieren. Nach dem Auftauen wurden 1 cm² große Schwartestücke dreimal jeweils 20 Minuten lang mit PBS, 0,6 % Natriumhypochlorit und 70 % Ethanol gewaschen. Vor dem Entfernen der Epidermis wurden alle Ethanolreste durch dreimaliges Waschen mit steriler PBS entfernt. Die Schwarte wurde in einer 6-Well-Platte mit einer 0,45 µm dicken Nylonmembran (Merck-Millipore) und drei Absorptionskissen (Merck-Millipore) kultiviert. Die Kultur enthielt 3 ml fötales Kälberserum (Sigma), ergänzt mit 10 % Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Dulbecco’s Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Koloniebildende Biofilme wurden wie für Biofilm-Expositionsstudien beschrieben angezüchtet. Nach 72-stündiger Kultivierung des Biofilms auf der Membran wurde dieser mit einer sterilen Impföse auf die Hautoberfläche aufgebracht und die Membran entfernt. Anschließend wurde der Biofilm für weitere 24 Stunden bei 37 °C auf der Schweinehaut inkubiert, um seine Reifung und Anhaftung zu ermöglichen. Nach der Reifung und Anhaftung des Biofilms wurde ein 1,5 cm² großer, mit sterilem destilliertem Wasser vorbefeuchteter Verband direkt auf die Hautoberfläche aufgelegt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Lebensfähige Bakterien wurden durch Anfärben sichtbar gemacht, indem PrestoBlue-Zellviabilitätsreagenz (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) gleichmäßig auf die apikale Oberfläche jedes Explantats aufgetragen und 5 Minuten inkubiert wurde. Die Bilder wurden mit der Digitalkamera Leica DFC425 direkt auf dem Mikroskop Leica MZ8 aufgenommen. Die rosa gefärbten Bereiche wurden mithilfe der Software Image Pro Version 10 (Media Cybernetics Inc., Rockville, MD, Image-Pro (mediacy.com)) quantifiziert. Die Rasterelektronenmikroskopie wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Über Nacht gezüchtete Bakterien wurden 1:100 in Mueller-Hinton-Bouillon verdünnt. 200 μl der Kultur wurden auf eine sterile 0,2 μm Whatman-Cyclopore-Membran (Whatman, Maidstone, UK) gegeben und auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausgestrichen. Die Biofilmplatten wurden 72 Stunden bei 37 °C inkubiert, um die Bildung eines reifen Biofilms zu ermöglichen.
Nach dreitägiger Biofilmreifung wurde ein 3 cm² großes Pflaster direkt auf den Biofilm aufgelegt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach Entfernen des Pflasters wurde 1 ml PrestoBlue-Zellviabilitätsreagenz (Invitrogen, Waltham, MA, USA) für 20 Sekunden auf die Oberfläche jedes Biofilms gegeben. Die Oberflächen wurden getrocknet, bevor die Farbveränderungen mit einer Digitalkamera Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK) dokumentiert wurden.
Über Nacht angelegte Kulturen auf Mueller-Hinton-Agar werden in 10 ml Mueller-Hinton-Bouillon überführt und auf einem Schüttler bei 37 °C (100 U/min) inkubiert. Nach der Inkubation wird die Kultur 1:100 in Mueller-Hinton-Bouillon verdünnt und 300 µl davon auf eine 0,2 µm große, runde Whatman-Cyclopore-Membran (Whatman International, Maidstone, UK) auf Mueller-Hinton-Agar aufgetragen und innerhalb von 72 Stunden bei 37 °C inkubiert. Der reife Biofilm wird wie unten beschrieben auf die Wunde aufgebracht.
Alle Tierversuche wurden an der Universität Manchester im Rahmen eines von der Ethikkommission für Tierversuche (Office of Animal Welfare and Ethical Review, P8721BD27) genehmigten Projekts und gemäß den Richtlinien des britischen Innenministeriums (Home Office) gemäß dem überarbeiteten ASPA von 2012 durchgeführt. Alle Autoren hielten sich an die Richtlinien für die Tierhaltung. Für alle In-vivo-Studien wurden acht Wochen alte C57BL/6j-Mäuse (Envigo, Oxon, UK) verwendet. Die Mäuse wurden mit Isofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK) anästhesiert, und ihre Rücken wurden rasiert und gereinigt. Anschließend wurde jeder Maus mit einer Stiefel-Biopsiestanze (Schuco International, Hertfordshire, UK) eine 2 × 6 mm große Exzisionswunde zugefügt. Bei Biofilm-infizierten Wunden wurde unmittelbar nach der Verletzung der auf der Membran gewachsene 72 Stunden alte Koloniebiofilm mit einer sterilen Impföse auf die Wunde aufgetragen und die Membran anschließend verworfen. Ein Quadratzentimeter Verbandmaterial wurde mit sterilem Wasser vorbefeuchtet, um ein feuchtes Wundmilieu zu gewährleisten. Die Verbände wurden direkt auf die Wunden aufgebracht und mit 3M Tegaderm-Folie (3M, Bracknell, UK) abgedeckt. Zur zusätzlichen Haftung wurde Mastisol-Flüssigkleber (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) an den Wundrändern aufgetragen. Buprenorphin (Animalcare, York, UK) wurde in einer Konzentration von 0,1 mg/kg als Analgetikum verabreicht. Drei Tage nach der Verletzung wurden die Mäuse gemäß Schema 1 getötet. Das Wundgebiet wurde nach Bedarf entnommen, halbiert und gelagert.
Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (beide Thermo Fisher Scientific) erfolgte gemäß Herstellerangaben. Wundfläche und Reepithelisierung wurden mit der Software Image Pro Version 10 (Media Cybernetics Inc., Rockville, MD) quantifiziert.
Die Gewebeschnitte wurden in Xylol (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK) entparaffiniert, mit einer aufsteigenden Ethanolreihe (100–50 %) rehydriert und kurz in deionisiertes Wasser (Thermo Fisher Scientific) getaucht. Die Immunhistochemie wurde mit dem VectaStain Elite ABC PK-6104 Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Primäre Antikörper gegen Neutrophile (NIMP-R14, Thermo Fisher Scientific) und Makrophagen (Ms CD107b Pure M3/84, BD Biosciences, Wokingham, UK) wurden 1:100 in Blockierungslösung verdünnt und auf die Schnittfläche aufgetragen. Anschließend wurden zwei Antikörper (Anti-), VectaStain ABC und das Vector Nova Red Peroxidase (HRP) Substratkit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) hinzugegeben und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem Olympus BX43 Mikroskop und einer Olympus DP73 Digitalkamera (Olympus, Southend-on-Sea, UK) aufgenommen.
Hautproben wurden in 2,5 % Glutaraldehyd und 4 % Formaldehyd in 0,1 M HEPES (pH 7,4) für 24 Stunden bei 4 °C fixiert. Anschließend wurden die Proben mit aufsteigenden Ethanolkonzentrationen entwässert und mit CO₂ in einem Quorum K850 Kritischpunkt-Trockner (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) getrocknet. Die Beschichtung mit einer Gold-Palladium-Legierung erfolgte mittels Sputtern mit einem Quorum SC7620 Mini-Sputter-/Glimmentladungssystem. Die Abbildung der Proben erfolgte mit einem FEI Quanta 250 Rasterelektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) zur Visualisierung des Wundzentrums.
Toto-1-Iodid (2 μM) wurde auf die exzidierte Wundfläche der Maus aufgetragen und 5 min bei 37 °C inkubiert (Thermo Fisher Scientific). Anschließend wurde die Wunde mit Syto-60 (10 μM) bei 37 °C behandelt (Thermo Fisher Scientific). Mithilfe eines Leica TCS SP8 wurden 15-minütige Z-Stapel-Aufnahmen erstellt.
Die Daten der biologischen und technischen Replikate wurden tabellarisch erfasst und mit der Software GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA) analysiert. Zur Prüfung der Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungen und dem nicht-antimikrobiellen Kontrollverband wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse mit anschließendem Dunnett-Test durchgeführt. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Die Wirksamkeit von Silbergel-Faserverbänden wurde zunächst in vitro an Biofilmkolonien von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa untersucht. Silberverbände enthalten unterschiedliche Silberformulierungen: Traditionelle Silberverbände produzieren Ag1+-Ionen; Silberverbände, die nach Zugabe von EDTA/BC Ag1+-Ionen bilden können, zerstören die Biofilmmatrix und setzen die Bakterien unter der antibakteriellen Wirkung von Silberionen dem Silber aus15; und Verbände mit oxygenierten Silbersalzen, die Ag1+-, Ag2+- und Ag3+-Ionen produzieren. Die Wirksamkeit wurde mit einem nicht-antimikrobiellen Kontrollverband aus Gelfasern verglichen. Die verbleibenden lebensfähigen Bakterien im Biofilm wurden 8 Tage lang alle 24 Stunden bestimmt (Abbildung 1). Am 5. Tag wurde der Biofilm mit 3,85 × 105 Staphylococcus aureus oder 1,22 × 105 P. aeruginosa erneut beimpft, um die Biofilmregeneration zu beurteilen. Im Vergleich zu nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden hatten Ag1+-Verbände über 5 Tage nur einen minimalen Effekt auf die bakterielle Lebensfähigkeit in Biofilmen von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa. Im Gegensatz dazu waren Verbände mit oxygeniertem Ag und Ag1+ + EDTA/BC-Salzen innerhalb von 5 Tagen wirksam bei der Abtötung von Bakterien im Biofilm. Nach wiederholter Inokulation mit planktonischen Bakterien am 5. Tag wurde keine Wiederherstellung des Biofilms beobachtet (Abb. 1).
Quantifizierung lebensfähiger Bakterien in Biofilmen von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa nach Behandlung mit Silberverbänden. Biofilmkolonien von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa wurden mit Silberverbänden oder nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden behandelt, und die Anzahl der verbleibenden lebensfähigen Bakterien wurde alle 24 Stunden bestimmt. Nach 5 Tagen wurde der Biofilm erneut mit 3,85 × 10⁵ S. Staphylococcus aureus oder 1,22 × 10⁵ P. Kolonien des Bakterioplanktons Pseudomonas aeruginosa wurden einzeln angelegt, um die Biofilmregeneration zu beurteilen. Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± Standardfehler.
Um den Einfluss von Silberverbänden auf die Lebensfähigkeit von Biofilmen zu visualisieren, wurden Verbände auf reife, ex vivo auf Schweinehaut gezüchtete Biofilme aufgebracht. Nach 24 Stunden wurde der Verband entfernt und der Biofilm mit einem blauen Reaktivfarbstoff angefärbt, der von lebenden Bakterien zu einer rosa Färbung umgewandelt wird. Biofilme, die mit Kontrollverbänden behandelt wurden, waren rosa, was auf das Vorhandensein lebensfähiger Bakterien im Biofilm hinweist (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu war der mit dem Ag-Oxysol-Verband behandelte Biofilm überwiegend blau, was darauf hindeutet, dass die verbleibenden Bakterien auf der Oberfläche der Schweinehaut nicht lebensfähig waren (Abbildung 2B). Eine gemischte blaue und rosa Färbung wurde in Biofilmen beobachtet, die mit Ag1+-haltigen Verbänden behandelt wurden, was auf das Vorhandensein lebensfähiger und nicht lebensfähiger Bakterien im Biofilm hinweist (Abbildung 2C). EDTA/BC-Verbände mit Ag1+ waren überwiegend blau mit einigen rosa Flecken, die Bereiche anzeigen, die nicht vom Silberverband beeinflusst wurden (Abbildung 2D). Die Quantifizierung aktiver (rosa) und inaktiver (blauer) Bereiche zeigte, dass das Kontrollpflaster zu 75 % aktiv war (Abbildung 2E). Ag1+ + EDTA/BC-Verbände zeigten eine ähnliche Wirkung wie sauerstoffangereicherte Ag-Salz-Verbände mit Überlebensraten von 13 % bzw. 14 %. Der Ag1+-Verband reduzierte zudem die bakterielle Lebensfähigkeit um 21 %. Diese Biofilme wurden anschließend mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Nach Behandlung mit dem Kontrollverband und dem Ag1+-Verband war eine Schicht von Pseudomonas aeruginosa auf der Schweinehaut zu beobachten (Abbildung 2F,H). Nach Behandlung mit dem Ag1+-Verband fanden sich hingegen nur wenige Bakterienzellen, auch darunter. Kollagenfasern können als Gewebestruktur der Schweinehaut betrachtet werden (Abbildung 2G). Nach Behandlung mit dem Ag1+ + EDTA/BC-Verband waren bakterielle Plaques und darunterliegende Kollagenfaserplaques sichtbar (Abbildung 2I).
Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa-Biofilmen nach Behandlung mit Silberverbänden. (A–D) Die Lebensfähigkeit von Pseudomonas aeruginosa-Biofilmen auf Schweinehaut wurde 24 Stunden nach Behandlung mit Silberverbänden bzw. nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden mithilfe des Lebensfähigkeitsfarbstoffs PrestoBlue visualisiert. Lebende Bakterien erscheinen rosa, nicht lebensfähige Bakterien und Schweinehaut blau. (E) Quantifizierung von Pseudomonas aeruginosa-Biofilmen auf Schweinehaut (rosa Fleck) mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) mit Image Pro Version 10 (FI) nach 24-stündiger Behandlung mit einem Silberverband bzw. einem nicht-antimikrobiellen Kontrollverband. REM-Maßstabsbalken = 5 µm. (J–M) Kolonienbildende Biofilme wuchsen auf Filtern und wurden nach 24-stündiger Inkubation mit Silberverbänden mit dem Reaktivfarbstoff PrestoBlue angefärbt.
Um festzustellen, ob der enge Kontakt zwischen den Verbänden und den Biofilmen die Wirksamkeit der Verbände beeinflusst, wurden koloniale Biofilme auf einer flachen Oberfläche 24 Stunden lang mit den Verbänden behandelt und anschließend mit Reaktivfarbstoffen angefärbt. Der unbehandelte Biofilm war dunkelrosa (Abbildung 2J). Im Gegensatz zu Biofilmen, die mit Verbänden mit oxygenierten Ag-Salzen behandelt wurden (Abbildung 2K), zeigten Biofilme, die mit Verbänden mit Ag1+ oder Ag1+ + EDTA/BC behandelt wurden, rosafarbene Färbebänder (Abbildung 2L,M). Diese rosa Färbung weist auf das Vorhandensein lebensfähiger Bakterien hin und ist mit dem Nahtbereich innerhalb des Verbandes assoziiert. Diese eingenähten Bereiche bilden Hohlräume, die das Überleben von Bakterien im Biofilm ermöglichen.
Um die Wirksamkeit von Silberverbänden in vivo zu untersuchen, wurden Vollhautwunden von Mäusen, die mit reifen Biofilmen von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa infiziert waren, mit nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden oder Silberverbänden behandelt. Nach dreitägiger Behandlung zeigte die makroskopische Bildanalyse kleinere Wundgrößen bei Behandlung mit sauerstoffangereicherten Salzverbänden im Vergleich zu nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden und anderen Silberverbänden (Abbildung 3A–H). Zur Bestätigung dieser Beobachtungen wurden die Wunden entnommen und Wundfläche sowie Reepithelisierung an Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Gewebeschnitten mithilfe der Software Image Pro Version 10 quantifiziert (Abbildung 3I–L).
Die Wirkung von Silberverbänden auf die Wundoberfläche und die Reepithelisierung von mit Biofilmen infizierten Wunden. (A–H) Kleine Zellen, die mit Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa (A–D) und Staphylococcus aureus (E–H) infiziert sind, nach dreitägiger Behandlung mit einem nicht-antimikrobiellen Kontrollverband, einem sauerstoffangereicherten Silbersalzverband, einem Ag1+-Verband und einem Ag1+-Verband. Repräsentative makroskopische Bilder. Wunden von Mäusen mit Ag1+ + EDTA/BC-Verband. (IL) Repräsentative Pseudomonas-aeruginosa-Infektion, histologische Schnitte, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, zur Quantifizierung der Wundfläche und der Epithelregeneration. Quantifizierung der Wundfläche (M, O) und des prozentualen Reepithelisierungsgrades (N, P) von Wunden, die mit Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa (M, N) und Staphylococcus aureus (O, P) infiziert sind (pro Behandlungsgruppe n = 12). Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± Standardfehler. * bedeutet p ≤ 0,05; ** bedeutet p ≤ 0,01; Makroskopischer Maßstab = 2,5 mm, histologischer Maßstab = 500 µm.
Die Quantifizierung der Wundfläche in mit Pseudomonas aeruginosa-Biofilm infizierten Wunden (Abbildung 3M) zeigte, dass mit Ag-Oxysalzen behandelte Wunden eine durchschnittliche Wundgröße von 2,5 mm² aufwiesen, während die Wundfläche der nicht-antimikrobiellen Kontrollbehandlung durchschnittlich 3,1 mm² betrug (p = 0,423). Wunden, die mit Ag1+ oder Ag1+ + EDTA/BC behandelt wurden, zeigten keine Reduktion der Wundfläche (3,1 mm² bzw. 3,6 mm²). Die Behandlung mit oxygeniertem Ag-Salz-Verband förderte die Reepithelisierung stärker als der nicht-antimikrobielle Kontrollverband (34 % bzw. 15 %; p = 0,029) und Ag1+ bzw. Ag1+ + EDTA/BC (10 % bzw. 11 %) (Abbildung 3N).
Ähnliche Tendenzen hinsichtlich Wundfläche und Epithelregeneration wurden bei Wunden beobachtet, die mit S. aureus-Biofilmen infiziert waren (Abb. 3O). Verbände mit oxygenierten Silbersalzen reduzierten die Wundfläche (2,0 mm²) um 23 % im Vergleich zum nicht-antimikrobiellen Kontrollverband (2,6 mm²), wobei diese Reduktion jedoch nicht signifikant war (p = 0,304) (Abb. 3O). Die Wundfläche in der Ag1+-Behandlungsgruppe war ebenfalls leicht reduziert (2,4 mm²), während die Wundfläche bei der Behandlung mit dem Ag1+ + EDTA/BC-Verband nicht verringert war (2,9 mm²). Sauerstoffhaltige Silbersalze förderten die Reepithelisierung von mit S. aureus-Biofilm infizierten Wunden (31 %) zudem stärker als die mit nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden behandelten Wunden (12 %, p = 0,003) (Abb. 3P). Bei den Verbänden Ag1+ (16%, p = 0,903) und Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) war die Epithelregeneration ähnlich wie in der Kontrollgruppe.
Um den Effekt von Silberverbänden auf die Biofilmmatrix zu visualisieren, wurde eine Färbung mit Toto-1- und Syto-60-Iodid durchgeführt (Abb. 4). Toto-1-Iodid ist ein zellundurchlässiger Farbstoff, der zur präzisen Darstellung extrazellulärer Nukleinsäuren dient, welche in der extrazellulären polymeren Substanz (EPS) von Biofilmen reichlich vorhanden sind. Syto 60 ist ein zelldurchlässiger Farbstoff, der als Gegenfärbung verwendet wird16. Beobachtungen von Toto-1- und Syto-60-Iodid in Wunden, die mit Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa (Abb. 4A–D) und Staphylococcus aureus (Abb. 4I–L) beimpft wurden, zeigten, dass die EPS im Biofilm nach dreitägiger Verbandbehandlung signifikant reduziert war. Die Wundauflagen enthielten oxygenierte Salze Ag und Ag+ + EDTA/BC. Ag1+ Wundauflagen ohne zusätzliche antibiofilmische Komponenten reduzierten die zellfreie DNA in mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Wunden signifikant, waren aber in mit Staphylococcus aureus infizierten Wunden weniger wirksam.
In-vivo-Bildgebung von Wundbiofilm nach 3-tägiger Behandlung mit Kontroll- oder Silberverbänden. Konfokale Aufnahmen von Pseudomonas aeruginosa (A–D) und Staphylococcus aureus (I–L), gefärbt mit Toto 1 (grün) zur Visualisierung extrazellulärer Nukleinsäuren, einem Bestandteil extrazellulärer Biofilmpolymere. Intrazelluläre Nukleinsäuren werden mit Syto 60 (rot) angefärbt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Wunden, die mit Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa (E–H) und Staphylococcus aureus (M–P) infiziert sind, nach 3-tägiger Behandlung mit Kontroll- und Silberverbänden. Maßstabsbalken (REM): 5 µm. Maßstabsbalken (Konfokalmikroskopie): 50 µm.
Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass Mäuse, denen Biofilmkolonien von Pseudomonas aeruginosa (Abbildung 4E-H) und Staphylococcus aureus (Abbildung 4M-P) inokuliert wurden, nach 3 Tagen Behandlung mit allen Silberverbänden signifikant weniger Bakterien in ihren Wunden aufwiesen.
Um die Wirkung von Silberverbänden auf die Wundentzündung bei Biofilm-infizierten Mäusen zu untersuchen, wurden Schnitte von Biofilm-infizierten Wunden, die drei Tage lang mit Kontroll- oder Silberverbänden behandelt wurden, immunhistochemisch mit Antikörpern gegen Neutrophile und Makrophagen gefärbt. Die quantitative Bestimmung von Neutrophilen und Makrophagen erfolgte im Granulationsgewebe (Abbildung 5). Alle Silberverbände reduzierten die Anzahl der Neutrophilen und Makrophagen in mit Pseudomonas aeruginosa infizierten Wunden nach dreitägiger Behandlung im Vergleich zu nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden. Die Behandlung mit dem sauerstoffangereicherten Silbersalzverband führte jedoch zu einer stärkeren Reduktion der Neutrophilen (p < 0,0001) und Makrophagen (p < 0,0001) als die anderen getesteten Silberverbände (Abbildung 5I,J). Obwohl Ag1+ + EDTA/BC eine stärkere Wirkung auf den Wundbiofilm hatte, reduzierte es die Neutrophilen- und Makrophagenwerte weniger stark als der Ag1+-Verband. Mäßig mit S. aureus-Biofilm infizierte Wunden wurden auch nach Verbandsbehandlung mit Ag (p < 0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) und Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) Oxisolen im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet. Ähnliche Tendenzen zeigten sich für Neutropenie. (Abb. 5K). Allerdings zeigte nur der mit Sauerstoff angereicherte Ag-Salzverband eine signifikante Reduktion der Makrophagenzahl im Granulationsgewebe im Vergleich zur Kontrollgruppe bei mit S. aureus-Biofilm infizierten Wunden (p = 0,0339) (Abb. 5L).
Neutrophile und Makrophagen wurden in Wunden quantifiziert, die mit Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus infiziert waren, nachdem sie drei Tage lang mit nicht-antimikrobiellen Kontrollverbänden oder Silberverbänden behandelt worden waren. Die Quantifizierung von Neutrophilen (AD) und Makrophagen (EH) erfolgte in Gewebeschnitten, die mit spezifischen Antikörpern gegen Neutrophile bzw. Makrophagen angefärbt wurden. Abbildung 1 zeigt die Quantifizierung von Neutrophilen (I und K) und Makrophagen (J und L) in Wunden, die mit Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa (I und J) und Staphylococcus aureus (K und L) infiziert waren. N = 12 pro Gruppe. Die Diagramme zeigen Mittelwert ± Standardfehler und Signifikanzwerte im Vergleich zum nicht-antibakteriellen Kontrollverband. * bedeutet p ≤ 0,05, ** bedeutet p ≤ 0,01; *** bedeutet p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001.
Anschließend untersuchten wir den Effekt von Silberverbänden auf die infektionsunabhängige Wundheilung. Nicht infizierte Exzisionswunden wurden drei Tage lang mit einem nicht-antimikrobiellen Kontrollverband oder einem Silberverband behandelt (Abbildung 6). Von den getesteten Silberverbänden erschienen nur die mit dem sauerstoffangereicherten Salzverband behandelten Wunden makroskopisch kleiner als die mit dem Kontrollverband behandelten Wunden (Abbildung 6A–D). Die histologische Analyse der Wundfläche ergab eine durchschnittliche Wundfläche von 2,35 mm² nach Behandlung mit dem Ag-Oxysol-Verband im Vergleich zu 2,96 mm² in der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant (p = 0,488) (Abb. 6I). Im Gegensatz dazu zeigte sich nach Behandlung mit Ag⁺- (3,38 mm², p = 0,757) oder Ag⁺ + EDTA/BC-Verbänden (4,18 mm², p = 0,054) keine Reduktion der Wundfläche im Vergleich zur Kontrollgruppe. Mit dem Ag-Oxysol-Verband wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe eine erhöhte Epithelregeneration beobachtet (30 % bzw. 22 %). Obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war (p = 0,067), ist er dennoch bemerkenswert und bestätigt frühere Ergebnisse. Ein Verband mit Oxysolen fördert die Reepithelisierung. – Epithelisierung nicht infizierter Wunden17. Im Gegensatz dazu zeigte die Behandlung mit Ag1+- oder Ag1+ + EDTA/BC-Verbänden keine Wirkung oder führte im Vergleich zur Kontrolle zu einer verminderten Reepithelisierung.
Wirkung eines Silberverbandes auf die Wundheilung bei nicht infizierten Mäusen nach vollständiger Resektion. (AD) Repräsentative makroskopische Bilder von Wunden nach dreitägiger Behandlung mit einem nicht-antimikrobiellen Kontrollverband und einem Silberverband. (EH) Repräsentative Wundschnitte, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Die Wundfläche (I) und der Reepithelisierungsgrad (J) wurden anhand histologischer Schnitte in der Wundmitte mittels Bildanalysesoftware quantifiziert (n = 11–12 pro Behandlungsgruppe). Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± Standardfehler. * bedeutet p < 0,05.
Silber wird seit Langem als antimikrobielles Mittel in der Wundheilung eingesetzt, doch die vielen verschiedenen Formulierungen und Applikationsmethoden können zu Unterschieden in der antimikrobiellen Wirksamkeit führen18. Darüber hinaus sind die antibiofilmischen Eigenschaften spezifischer Silber-Applikationssysteme noch nicht vollständig erforscht. Obwohl die Immunantwort des Wirts relativ effektiv gegen planktonische Bakterien ist, ist sie gegen Biofilme im Allgemeinen weniger wirksam19. Planktonische Bakterien werden leicht von Makrophagen phagozytiert, doch innerhalb von Biofilmen stellen aggregierte Zellen zusätzliche Probleme dar, indem sie die Wirtsantwort so weit einschränken, dass Immunzellen Apoptose durchlaufen und proinflammatorische Faktoren freisetzen können, um die Immunantwort zu verstärken20. Es wurde beobachtet, dass einige Leukozyten Biofilme durchdringen können21, aber nicht mehr in der Lage sind, Bakterien zu phagozytieren, sobald diese Abwehr geschwächt ist22. Ein ganzheitlicher Ansatz sollte verfolgt werden, um die Immunantwort des Wirts gegen Wundbiofilminfektionen zu unterstützen. Wunddebridement kann den Biofilm physikalisch aufbrechen und den Großteil der Keimbelastung entfernen, doch die Immunantwort des Wirts kann gegen verbleibenden Biofilm unwirksam sein, insbesondere wenn die Immunantwort des Wirts geschwächt ist. Antimikrobielle Therapien wie Silberverbände können die Immunantwort des Wirts unterstützen und Biofilminfektionen eliminieren. Zusammensetzung, Konzentration, Löslichkeit und Trägermaterial beeinflussen die antimikrobielle Wirksamkeit von Silber. Fortschritte in der Silberverarbeitungstechnologie haben in den letzten Jahren die Wirksamkeit dieser Verbände erhöht9,23. Angesichts dieser Weiterentwicklung ist es wichtig, die Wirksamkeit dieser Verbände bei der Kontrolle von Wundinfektionen und insbesondere die Auswirkungen dieser hochwirksamen Silberformen auf das Wundmilieu und die Wundheilung zu verstehen.
In dieser Studie verglichen wir die Wirksamkeit zweier fortschrittlicher Silberverbände mit der von herkömmlichen Silberverbänden, die Ag1+-Ionen freisetzen, gegen Biofilme anhand verschiedener In-vitro- und In-vivo-Modelle. Wir untersuchten außerdem den Einfluss dieser Verbände auf das Wundmilieu und die infektionsunabhängige Wundheilung. Um den Einfluss der Trägermatrix zu minimieren, bestanden alle getesteten Silberverbände aus Carboxymethylcellulose.
Unsere vorläufige Bewertung dieser Silberverbände gegen koloniale Biofilme von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zeigt, dass zwei fortschrittliche Silberverbände – Ag1+ + EDTA/BC und oxygenierte Ag-Salze – im Gegensatz zu herkömmlichen Ag1+-Verbänden Biofilmbakterien innerhalb weniger Tage effektiv abtöten. Darüber hinaus verhindern diese Verbände die Neubildung von Biofilm bei wiederholter Exposition gegenüber planktonischen Bakterien. Der Ag1+-Verband enthielt Silberchlorid, dieselbe Silberverbindung und Basismatrix wie Ag1+ + EDTA/BC, und hatte im gleichen Zeitraum nur eine geringe Wirkung auf die bakterielle Lebensfähigkeit im Biofilm. Die Beobachtung, dass ein Ag1+ + EDTA/BC-Verband wirksamer gegen Biofilm war als ein Ag1+-Verband mit derselben Matrix und einer Silberverbindung, stützt die Annahme, dass zusätzliche Inhaltsstoffe erforderlich sind, um die Wirksamkeit von Silberchlorid gegen Biofilm zu erhöhen, wie bereits an anderer Stelle berichtet wurde15. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass BC und EDTA zusätzlich zur Gesamtwirksamkeit von Wundauflagen beitragen und dass das Fehlen dieser Komponente in Ag1+-Wundauflagen möglicherweise zum Ausbleiben der Wirksamkeit in vitro beigetragen hat. Wir stellten fest, dass sauerstoffangereicherte Ag-Salz-Wundauflagen, die Ag2+- und Ag3+-Ionen produzieren, eine stärkere antibakterielle Wirkung als Ag1+ und eine ähnliche Wirkung wie Ag1+ + EDTA/BC aufwiesen. Aufgrund des hohen Redoxpotenzials ist jedoch unklar, wie lange Ag3+-Ionen aktiv und wirksam gegen Wundbiofilme bleiben, weshalb weitere Untersuchungen erforderlich sind. Darüber hinaus gibt es viele verschiedene Wundauflagen, die Ag1+-Ionen freisetzen und in dieser Studie nicht getestet wurden. Diese Wundauflagen bestehen aus unterschiedlichen Silberverbindungen, Konzentrationen und Trägermaterialien, was die Freisetzung von Ag1+-Ionen und deren Wirksamkeit gegen Biofilme beeinflussen kann. Es ist außerdem erwähnenswert, dass zahlreiche verschiedene In-vitro- und In-vivo-Modelle zur Bewertung der Wirksamkeit von Wundauflagen gegen Biofilme eingesetzt werden. Die Art des verwendeten Modells sowie der Salz- und Proteingehalt der verwendeten Medien beeinflussen die Wirksamkeit des Wundverbands. In unserem In-vivo-Modell ließen wir den Biofilm in vitro reifen und übertrugen ihn anschließend auf die Wundoberfläche. Die Immunantwort der Wirtsmaus ist relativ effektiv gegen planktonische Bakterien, die auf die Wunde aufgebracht werden, wodurch sich während der Wundheilung ein Biofilm bildet. Die Zugabe von reifem Biofilm zu einer Wunde schränkt die Wirksamkeit der Immunantwort des Wirts auf die Biofilmbildung ein, da sich der reife Biofilm in der Wunde etablieren kann, bevor die Heilung einsetzen kann. Daher erlaubt uns unser Modell, die Wirksamkeit antimikrobieller Wundverbände auf reife Biofilme zu beurteilen, bevor die Wundheilung beginnt.
Wir stellten außerdem fest, dass die Passform des Verbandes die Wirksamkeit von Silberverbänden auf in vitro gezüchtete Biofilme und Schweinehaut beeinflusst. Ein enger Wundkontakt gilt als entscheidend für die antimikrobielle Wirksamkeit des Verbandes24,25. Verbände mit oxygenierten Silbersalzen standen in engem Kontakt mit reifen Biofilmen, was nach 24 Stunden zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl lebensfähiger Bakterien im Biofilm führte. Im Gegensatz dazu blieben bei Behandlung mit Ag1+- und Ag1+ + EDTA/BC-Verbänden signifikante Mengen lebensfähiger Bakterien erhalten. Diese Verbände sind über ihre gesamte Länge vernäht, wodurch Hohlräume entstehen, die einen engen Kontakt mit dem Biofilm verhindern. In unseren In-vitro-Studien verhinderten diese kontaktlosen Bereiche die Abtötung lebensfähiger Bakterien im Biofilm. Wir untersuchten die bakterielle Lebensfähigkeit nur nach 24 Stunden Behandlung. Mit zunehmender Sättigung des Verbandes kann sich der Hohlraum verringern, wodurch die Fläche für diese lebensfähigen Bakterien reduziert wird. Dies unterstreicht jedoch die Bedeutung der Verbandzusammensetzung und nicht nur der Art des verwendeten Silbers.
Während In-vitro-Studien zwar nützlich sind, um die Wirksamkeit verschiedener Silbertechnologien zu vergleichen, ist es ebenso wichtig, die Wirkung dieser Wundauflagen auf Biofilme in vivo zu verstehen, da Wirtsgewebe und Immunreaktionen maßgeblich zur Wirksamkeit der Wundauflagen gegen Biofilme beitragen. Die Wirkung dieser Wundauflagen auf Wundbiofilme wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie und EPS-Färbung des Biofilms mit intrazellulären und extrazellulären DNA-Farbstoffen untersucht. Wir stellten fest, dass nach dreitägiger Behandlung alle Wundauflagen die zellfreie DNA in Biofilm-infizierten Wunden effektiv reduzierten, die Ag1+-Wundauflage jedoch bei mit Staphylococcus aureus infizierten Wunden weniger wirksam war. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten zudem, dass in mit den Silberverbänden behandelten Wunden signifikant weniger Bakterien vorhanden waren. Dieser Effekt war bei der sauerstoffangereicherten Ag-Salz-Wundauflage und der Ag1+ + EDTA/BC-Wundauflage im Vergleich zur Ag1+-Wundauflage deutlicher ausgeprägt. Diese Daten zeigen, dass die getesteten Silberverbände die Biofilmstruktur unterschiedlich stark beeinflussten, jedoch keiner den Biofilm vollständig eliminieren konnte. Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines ganzheitlichen Behandlungsansatzes für Wundbiofilminfektionen, einschließlich der Verwendung von Silberarmbändern. Der Behandlung geht ein mechanisches Débridement voraus, um den Biofilm weitestgehend zu entfernen.
Chronische Wunden befinden sich häufig in einem Zustand starker Entzündung, wobei überschüssige Entzündungszellen über einen längeren Zeitraum im Wundgewebe verbleiben. Dies führt zu Gewebeschäden und verringert die Sauerstoffversorgung, die für einen effizienten Zellstoffwechsel und die Zellfunktion in der Wunde notwendig ist.26 Biofilme verschlimmern dieses ungünstige Wundmilieu, indem sie die Heilung auf vielfältige Weise negativ beeinflussen, unter anderem durch Hemmung der Zellproliferation und -migration sowie Aktivierung proinflammatorischer Zytokine.27 Da Silberverbände zunehmend wirksamer werden, ist es wichtig, ihre Auswirkungen auf das Wundmilieu und die Wundheilung zu verstehen.
Interessanterweise beeinflussten zwar alle Silberverbände die Biofilmzusammensetzung, jedoch erhöhten nur sauerstoffangereicherte Silbersalzverbände die Reepithelisierung dieser infizierten Wunden. Diese Daten bestätigen unsere früheren Ergebnisse17 sowie die von Kalan et al. (2017)28, die ein gutes Sicherheits- und Toxizitätsprofil sauerstoffangereicherter Silbersalze belegten, da bereits niedrigere Silberkonzentrationen gegen Biofilme wirksam waren.
Unsere aktuelle Studie hebt die Unterschiede in der Silbertechnologie antimikrobieller Silberverbände und deren Einfluss auf das Wundmilieu und die infektionsunabhängige Wundheilung hervor. Diese Ergebnisse unterscheiden sich jedoch von früheren Studien, die eine Verbesserung der Heilungsparameter verletzter Kaninchenohren durch Ag1+ + EDTA/BC-Verbände in vivo zeigten. Dies könnte jedoch auf Unterschiede in den Tiermodellen, Messzeitpunkten und Methoden der Bakterienapplikation zurückzuführen sein29. In diesem Fall wurden die Wundmessungen 12 Tage nach der Verletzung durchgeführt, um den Wirkstoffen des Verbandes eine längere Einwirkungszeit auf den Biofilm zu ermöglichen. Dies wird durch eine Studie gestützt, die zeigte, dass klinisch infizierte Beingeschwüre, die mit Ag1+ + EDTA/BC behandelt wurden, nach einer Woche zunächst an Größe zunahmen und sich dann in den folgenden drei Behandlungswochen mit Ag1+ + EDTA/BC sowie innerhalb von vier Wochen nach Anwendung nicht-antimikrobieller Medikamente und CMC-Verbänden zur Reduzierung der Geschwürgröße verringerten30.
Bestimmte Silberformen und -konzentrationen zeigten sich in vitro zytotoxisch11, doch lassen sich diese Ergebnisse nicht immer auf In-vivo-Effekte übertragen. Fortschritte in der Silbertechnologie und ein besseres Verständnis von Silberverbindungen und -konzentrationen in Wundauflagen haben zur Entwicklung zahlreicher sicherer und wirksamer Silberverbände geführt. Mit dem Fortschritt der Silberverbandtechnologie ist es jedoch wichtig, die Auswirkungen dieser Verbände auf das Wundmilieu zu verstehen31,32,33. Frühere Studien zeigten, dass eine erhöhte Reepithelisierungsrate mit einem höheren Anteil antiinflammatorischer M2-Makrophagen im Vergleich zum proinflammatorischen M1-Phänotyp einhergeht. Dies wurde in einem Mausmodell beobachtet, in dem Silberhydrogel-Wundverbände mit Silbersulfadiazin und nicht-antimikrobiellen Hydrogelen verglichen wurden34.
Chronische Wunden können übermäßige Entzündungen aufweisen, und es wurde beobachtet, dass ein Überschuss an Neutrophilen die Wundheilung beeinträchtigen kann35. In einer Studie an neutrophilen-depletierten Mäusen verzögerte das Vorhandensein von Neutrophilen die Reepithelisierung. Ein Überschuss an Neutrophilen führt zu erhöhten Konzentrationen von Proteasen und reaktiven Sauerstoffspezies wie Superoxid und Wasserstoffperoxid, die mit chronischen und schlecht heilenden Wunden assoziiert sind37,38. Ebenso kann eine unkontrollierte Zunahme der Makrophagenzahl zu einer verzögerten Wundheilung führen39. Diese Zunahme ist besonders relevant, wenn Makrophagen nicht in der Lage sind, von einem proinflammatorischen zu einem proheilungsfördernden Phänotyp zu wechseln, wodurch die Wunde die Entzündungsphase der Heilung nicht verlässt40. Wir beobachteten nach dreitägiger Behandlung mit allen Silberverbänden eine Abnahme der Neutrophilen und Makrophagen in Biofilm-infizierten Wunden, wobei die Abnahme bei sauerstoffangereicherten Salzverbänden stärker ausgeprägt war. Diese Abnahme könnte eine direkte Folge der Immunantwort auf Silber, eine Reaktion auf die verringerte Keimbelastung oder darauf zurückzuführen sein, dass sich die Wunde in einem fortgeschrittenen Heilungsstadium befindet und daher weniger Immunzellen in der Wunde vorhanden sind. Die Reduzierung der Anzahl entzündlicher Zellen in der Wunde kann ein heilungsförderndes Milieu schaffen. Der Wirkmechanismus, wie Silberoxysalze die infektionsunabhängige Heilung fördern, ist unklar. Die Fähigkeit von Silberoxysalzen, Sauerstoff zu produzieren und schädliche Mengen an Wasserstoffperoxid, einem Entzündungsmediator, abzubauen, könnte dies jedoch erklären und bedarf weiterer Untersuchungen17.
Chronische, nicht heilende, infizierte Wunden stellen sowohl für Ärzte als auch für Patienten ein Problem dar. Obwohl viele Wundauflagen antimikrobielle Wirksamkeit versprechen, konzentriert sich die Forschung selten auf andere Schlüsselfaktoren, die das Wundmikromilieu beeinflussen. Diese Studie zeigt, dass verschiedene Silbertechnologien eine unterschiedliche antimikrobielle Wirksamkeit und – was besonders wichtig ist – unterschiedliche Auswirkungen auf das Wundmikromilieu und die Wundheilung haben, unabhängig von einer Infektion. Obwohl diese In-vitro- und In-vivo-Studien die Wirksamkeit dieser Wundauflagen bei der Behandlung von Wundinfektionen und der Förderung der Heilung belegen, sind randomisierte, kontrollierte Studien erforderlich, um die Wirksamkeit dieser Wundauflagen in der klinischen Praxis zu evaluieren.
Die im Rahmen dieser Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze können auf Anfrage beim korrespondierenden Autor angefordert werden.
Veröffentlichungsdatum: 15. Juli 2024