Heterogenität der menschlichen Skelettmuskelfasern jenseits der schweren Myosinkette

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Die Skelettmuskulatur ist ein heterogenes Gewebe, das überwiegend aus Myofibrillen besteht. Diese werden beim Menschen typischerweise in drei Typen unterteilt: einen „langsamen“ (Typ 1) und zwei „schnelle“ (Typen 2A und 2X). Die Heterogenität zwischen und innerhalb dieser traditionellen Myofibrillentypen ist jedoch noch unzureichend erforscht. Wir untersuchten 1050 bzw. 1038 einzelne Myofibrillen des Musculus vastus lateralis mittels transkriptomischer und proteomischer Analysen. Die proteomische Studie umfasste Männer, die transkriptomische Studie 10 Männer und 2 Frauen. Neben Isoformen der schweren Myosinkette identifizierten wir Stoffwechselproteine, ribosomale Proteine ​​und Zellverbindungsproteine ​​als Quellen multidimensionaler intermyofibrillärer Variabilität. Trotz der Identifizierung von Clustern langsamer und schneller Fasern deuten unsere Daten darauf hin, dass sich Typ-2X-Fasern phänotypisch nicht von anderen schnellzuckenden Fasern unterscheiden. Darüber hinaus ist die auf der schweren Myosinkette basierende Klassifizierung unzureichend, um den Myofiber-Phänotyp bei nemalinen Myopathien zu beschreiben. Insgesamt deuten unsere Daten auf eine multidimensionale Myofiber-Heterogenität hin, deren Variationsquellen über die Isoformen der schweren Myosinkette hinausgehen.
Zelluläre Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal aller biologischen Systeme und ermöglicht es Zellen, sich zu spezialisieren, um den unterschiedlichen Bedürfnissen von Geweben und Zellen gerecht zu werden.¹ Traditionell ging man davon aus, dass Motoneuronen den Fasertyp innerhalb einer motorischen Einheit definieren und dass dieser Fasertyp (d. h. Typ 1, Typ 2A und Typ 2X beim Menschen) durch die Eigenschaften der Isoformen der schweren Myosinkette (MYH) bestimmt wird.² Dies basierte zunächst auf ihrer pH-ATPase-Instabilität^3,4 und später auf ihrer molekularen Expression von MYH.⁵ Mit der Identifizierung und anschließenden Akzeptanz von „gemischten“ Fasern, die mehrere MYHs in unterschiedlichen Anteilen koexprimieren, werden Skelettmuskelfasern jedoch zunehmend als Kontinuum und nicht als distinkte Fasertypen betrachtet.⁶ Trotzdem stützt sich die Forschung weiterhin stark auf MYH als primären Klassifikator für die Myofiberklassifizierung – eine Sichtweise, die wahrscheinlich durch die Einschränkungen und signifikanten Verzerrungen früher Nagetierstudien beeinflusst ist, deren MYH-Expressionsprofile und Fasertypenspektrum sich von denen in der Forschung unterscheiden. Die Situation wird zusätzlich dadurch verkompliziert, dass verschiedene menschliche Skelettmuskeln eine Vielzahl von Fasertypen aufweisen.⁷ Der Vastus lateralis ist ein Mischmuskel mit einem intermediären (und daher repräsentativen) MYH-Expressionsprofil.⁷ Darüber hinaus ist er aufgrund seiner einfachen Probenentnahme der am besten untersuchte Muskel beim Menschen.
Die unvoreingenommene Untersuchung der Diversität von Skelettmuskelfasern mithilfe leistungsstarker Omics-Technologien ist daher unerlässlich, aber auch eine Herausforderung, unter anderem aufgrund der Vielkernigkeit der Skelettmuskelfasern. Transkriptomik^8,9 und Proteomik¹⁰ haben jedoch in den letzten Jahren dank verschiedener technologischer Fortschritte eine Revolution in ihrer Sensitivität erfahren, die die Analyse von Skelettmuskeln bis hin zur Einzelfaserauflösung ermöglicht. Dadurch konnten bedeutende Fortschritte bei der Charakterisierung der Einzelfaserdiversität und ihrer Reaktion auf atrophische Reize und Alterungsprozesse erzielt werden^{11,12,13,14,15,16,17,18}. Wichtig ist, dass diese technologischen Fortschritte klinische Anwendung finden und eine detailliertere und präzisere Charakterisierung krankheitsbedingter Dysregulationen ermöglichen. Die Pathophysiologie der Nemalin-Myopathie, einer der häufigsten erblichen Muskelerkrankungen (MIM 605355 und MIM 161800), ist beispielsweise komplex und schwer verständlich.19,20 Daher könnte eine bessere Charakterisierung der Dysregulation der Skelettmuskelfasern zu bedeutenden Fortschritten in unserem Verständnis dieser Erkrankung führen.
Wir entwickelten Methoden zur transkriptomischen und proteomischen Analyse einzelner, manuell aus menschlichen Biopsieproben isolierter Skelettmuskelfasern und wandten diese auf Tausende von Fasern an. Dies ermöglichte uns die Untersuchung der zellulären Heterogenität menschlicher Skelettmuskelfasern. Im Rahmen dieser Arbeit demonstrierten wir die Leistungsfähigkeit der transkriptomischen und proteomischen Phänotypisierung von Muskelfasern und identifizierten metabolische, ribosomale und zelluläre Verbindungsproteine ​​als wichtige Quellen der Variabilität zwischen den Fasern. Mithilfe dieses proteomischen Workflows charakterisierten wir zudem die klinische Relevanz der Nematodenmyopathie in einzelnen Skelettmuskelfasern und zeigten eine koordinierte Verschiebung hin zu nicht-oxidativen Fasern, unabhängig vom Fasertyp, basierend auf MYH.
Um die Heterogenität menschlicher Skelettmuskelfasern zu untersuchen, entwickelten wir zwei Arbeitsabläufe zur Transkriptom- und Proteomanalyse einzelner Skelettmuskelfasern (Abbildung 1A und Ergänzende Abbildung 1A). Wir entwickelten und optimierten mehrere methodische Schritte, von der Probenlagerung und dem Erhalt der RNA- und Proteinintegrität bis hin zur Optimierung des Durchsatzes für jeden Ansatz. Für die Transkriptomanalyse wurde dies durch das Einfügen probenspezifischer molekularer Barcodes im ersten Schritt der reversen Transkription erreicht, wodurch 96 Fasern für eine effiziente Weiterverarbeitung gepoolt werden konnten. Eine tiefere Sequenzierung (ca. 1 Million Reads pro Faser) im Vergleich zu traditionellen Einzelzellansätzen reicherte die Transkriptomdaten zusätzlich an.²¹ Für die Proteomik verwendeten wir einen kurzen chromatographischen Gradienten (21 Minuten) in Kombination mit der DIA-PASEF-Datenerfassung auf einem timsTOF-Massenspektrometer, um die Proteomtiefe zu optimieren und gleichzeitig einen hohen Durchsatz zu gewährleisten. 22,23 Um die Heterogenität gesunder Skelettmuskelfasern zu untersuchen, charakterisierten wir die Transkriptome von 1.050 einzelnen Fasern von 14 gesunden erwachsenen Spendern und die Proteome von 1.038 Fasern von 5 gesunden erwachsenen Spendern (Ergänzungstabelle 1). In dieser Arbeit werden diese Datensätze als 1.000-Faser-Transkriptome bzw. -Proteome bezeichnet. Unser Ansatz detektierte insgesamt 27.237 Transkripte und 2.983 Proteine ​​in den Transkriptom- und Proteomanalysen der 1.000 Fasern (Abbildung 1A, Ergänzungsdatensätze 1–2). Nach dem Filtern der Transkriptom- und Proteomdatensätze nach >1.000 detektierten Genen und 50 % gültigen Werten pro Faser wurden nachfolgende bioinformatische Analysen für 925 bzw. 974 Fasern im Transkriptom bzw. Proteom durchgeführt. Nach der Filterung wurden pro Faser durchschnittlich 4257 ± 1557 Gene und 2015 ± 234 Proteine ​​(Mittelwert ± Standardabweichung) detektiert, mit geringer interindividueller Variabilität (Ergänzende Abbildungen 1B–C, Ergänzende Datensätze 3–4). Die Variabilität innerhalb der Probanden war jedoch deutlich ausgeprägter, wahrscheinlich aufgrund von Unterschieden in der RNA-/Proteinausbeute zwischen Fasern unterschiedlicher Länge und Querschnittsfläche. Für die meisten Proteine ​​(>2000) lag der Variationskoeffizient unter 20 % (Ergänzende Abbildung 1D). Beide Methoden ermöglichten die Erfassung eines breiten dynamischen Spektrums an Transkripten und Proteinen mit stark exprimierten Signaturen, die für die Muskelkontraktion wichtig sind (z. B. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Ergänzende Abbildungen 1E–F). Die meisten der identifizierten Merkmale waren in den Transkriptom- und Proteomdatensätzen identisch (Ergänzende Abbildung 1G), und die mittleren UMI/LFQ-Intensitäten dieser Merkmale korrelierten recht gut (r = 0,52) (Ergänzende Abbildung 1H).
Workflow für Transkriptomik und Proteomik (erstellt mit BioRender.com). BD: Dynamische Bereichskurven für MYH7, MYH2 und MYH1 sowie berechnete Schwellenwerte für die Fasertypzuordnung. E, F: Verteilung der MYH-Expression in den Fasern der Transkriptomik- und Proteomik-Datensätze. G, H: UMAP-Plots (Uniform Diversity Approximation and Projection) für Transkriptomik und Proteomik, farblich dargestellt nach MYH-basiertem Fasertyp. I, J: Feature-Plots zur Expression von MYH7, MYH2 und MYH1 in den Transkriptomik- und Proteomik-Datensätzen.
Wir haben zunächst versucht, jedem Fasertyp anhand der MYH-Expression zuzuordnen. Dazu verwendeten wir einen optimierten Ansatz, der die hohe Sensitivität und den dynamischen Bereich der MYH-Expression in Omics-Datensätzen nutzt. Frühere Studien verwendeten willkürliche Schwellenwerte, um Fasern basierend auf einem festen prozentualen Anteil der Expression verschiedener MYHs als reinen Typ 1, Typ 2A, Typ 2X oder gemischt zu kennzeichnen^11,14,24. Wir wählten einen anderen Ansatz, bei dem die Expression jeder Faser anhand der MYHs, die wir zur Typisierung der Fasern verwendeten, geordnet wurde: MYH7, MYH2 und MYH1 entsprechen den Typen 1, 2A bzw. 2X. Anschließend berechneten wir mathematisch den unteren Wendepunkt jeder resultierenden Kurve und verwendeten ihn als Schwellenwert, um Fasern für jedes MYH als positiv (oberhalb des Schwellenwerts) oder negativ (unterhalb des Schwellenwerts) zu klassifizieren (Abbildung 1B–D). Diese Daten zeigen, dass MYH7 (Abb. 1B) und MYH2 (Abb. 1C) auf RNA-Ebene deutlichere Expressionsmuster aufweisen als auf Proteinebene. Tatsächlich exprimierten auf Proteinebene nur sehr wenige Fasern kein MYH7, und keine Faser zeigte eine 100%ige MYH2-Expression. Anschließend verwendeten wir vordefinierte Expressionsschwellenwerte, um allen Fasern in jedem Datensatz MYH-basierte Fasertypen zuzuordnen. Beispielsweise wurden MYH7+/MYH2-/MYH1- Fasern dem Typ 1 zugeordnet, während MYH7-/MYH2+/MYH1+ Fasern dem gemischten Typ 2A/2X zugeordnet wurden (siehe Ergänzungstabelle 2 für eine detaillierte Beschreibung). In der Gesamtbetrachtung aller Fasern beobachteten wir eine bemerkenswert ähnliche Verteilung der MYH-basierten Fasertypen sowohl auf RNA- (Abb. 1E) als auch auf Proteinebene (Abb. 1F), während die relative Zusammensetzung der MYH-basierten Fasertypen erwartungsgemäß zwischen den Individuen variierte (Ergänzungsabbildung 2A). Die meisten Fasern wurden entweder als reiner Typ 1 (34–35 %) oder als Typ 2A (36–38 %) klassifiziert, wobei auch eine signifikante Anzahl gemischter 2A/2X-Fasern (16–19 %) nachgewiesen wurde. Ein auffälliger Unterschied besteht darin, dass reine Typ-2X-Fasern nur auf RNA-Ebene, nicht aber auf Proteinebene nachgewiesen werden konnten. Dies deutet darauf hin, dass die schnelle MYH-Expression zumindest teilweise posttranskriptionell reguliert wird.
Wir validierten unsere proteombasierte Methode zur MYH-Fasertypisierung mittels Antikörper-basiertem Dot-Blotting. Beide Methoden erzielten eine 100%ige Übereinstimmung bei der Identifizierung reiner Typ-1- und Typ-2A-Fasern (siehe Abbildung S2B im Anhang). Der proteombasierte Ansatz erwies sich jedoch als sensitiver und effizienter bei der Identifizierung gemischter Fasern sowie bei der Quantifizierung des Anteils jedes MYH-Gens in jeder Faser. Diese Daten belegen die Effektivität eines objektiven, hochsensitiven Omics-basierten Ansatzes zur Charakterisierung von Skelettmuskelfasertypen.
Anschließend nutzten wir die kombinierten Informationen aus Transkriptomik und Proteomik, um Muskelfasern anhand ihres vollständigen Transkriptoms bzw. Proteoms objektiv zu klassifizieren. Mithilfe der UMAP-Methode (Uniform Manifold Approximation and Projection) reduzierten wir die Dimensionalität auf sechs Hauptkomponenten (Ergänzende Abbildungen 3A–B) und konnten so die Variabilität der Muskelfasern im Transkriptom (Abbildung 1G) und Proteom (Abbildung 1H) visualisieren. Bemerkenswerterweise ließen sich die Muskelfasern weder in den Transkriptomik- noch in den Proteomik-Datensätzen nach Teilnehmern (Ergänzende Abbildungen 3C–D) oder Testtagen (Ergänzende Abbildung 3E) gruppieren. Dies deutet darauf hin, dass die Variabilität der Skelettmuskelfasern innerhalb eines Individuums höher ist als die Variabilität zwischen Individuen. In der UMAP-Darstellung zeigten sich zwei distinkte Cluster, die „schnelle“ und „langsame“ Muskelfasern repräsentieren (Abbildungen 1G–H). MYH7+ (langsame) Muskelfasern gruppierten sich am positiven Pol von UMAP1, während MYH2+ und MYH1+ (schnelle) Muskelfasern am negativen Pol von UMAP1 gruppiert waren (Abbildungen 1I–J). Es wurde jedoch keine Unterscheidung zwischen schnellzuckenden Fasertypen (d. h. Typ 2A, Typ 2X oder gemischter Typ 2A/2X) anhand der MYH-Expression getroffen. Dies deutet darauf hin, dass die Expression von MYH1 (Abbildungen 1I–J) oder anderen klassischen 2X-Muskelfasermarkern wie ACTN3 oder MYLK2 (Ergänzende Abbildungen 4A–B) keine Differenzierung zwischen verschiedenen Muskelfasertypen ermöglicht, wenn das gesamte Transkriptom oder Proteom betrachtet wird. Darüber hinaus korrelierten im Vergleich zu MYH2 und MYH7 nur wenige Transkripte oder Proteine ​​positiv mit MYH1 (Ergänzende Abbildungen 4C–H), was darauf hindeutet, dass die MYH1-Häufigkeit das Transkriptom/Proteom der Muskelfaser nicht vollständig widerspiegelt. Ähnliche Schlussfolgerungen wurden bei der Untersuchung der gemischten Expression der drei MYH-Isoformen auf UMAP-Ebene gezogen (Ergänzende Abb. 4I–J). Während sich 2X-Fasern also allein anhand der MYH-Quantifizierung auf Transkriptebene identifizieren lassen, sind MYH1+-Fasern unter Berücksichtigung des gesamten Transkriptoms oder Proteoms nicht von anderen schnellen Fasern zu unterscheiden.
Zur ersten Untersuchung der Heterogenität langsamer Muskelfasern jenseits von MYH analysierten wir vier etablierte, für langsame Muskelfasern spezifische Proteine: TPM3, TNNT1, MYL3 und ATP2A22. Die Subtypen langsamer Muskelfasern zeigten hohe, wenn auch nicht perfekte Pearson-Korrelationen mit MYH7 sowohl in der Transkriptomik (Ergänzende Abbildung 5A) als auch in der Proteomik (Ergänzende Abbildung 5B). Ungefähr 25 % bzw. 33 % der langsamen Muskelfasern wurden in der Transkriptomik (Ergänzende Abbildung 5C) bzw. Proteomik (Ergänzende Abbildung 5D) nicht anhand aller Gen-/Protein-Subtypen als reine langsame Muskelfasern klassifiziert. Die Klassifizierung langsamer Muskelfasern anhand mehrerer Gen-/Protein-Subtypen führt daher zu zusätzlicher Komplexität, selbst bei Proteinen, die bekanntermaßen fasertypspezifisch sind. Dies deutet darauf hin, dass die Klassifizierung von Muskelfasern anhand von Isoformen einer einzelnen Gen-/Proteinfamilie die tatsächliche Heterogenität der Skelettmuskelfasern möglicherweise nicht adäquat widerspiegelt.
Um die phänotypische Variabilität menschlicher Skelettmuskelfasern im Rahmen des gesamten Omics-Modells weiter zu untersuchen, führten wir eine unvoreingenommene Dimensionsreduktion der Daten mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) durch (Abbildung 2A). Ähnlich wie bei den UMAP-Plots beeinflussten weder die Versuchsperson noch der Testtag die Faserclusterung auf PCA-Ebene (Ergänzende Abbildungen 6A–C). In beiden Datensätzen wurde der MYH-basierte Fasertyp durch PC2 erklärt. PC2 zeigte einen Cluster von langsam zuckenden Typ-1-Fasern und einen zweiten Cluster mit schnell zuckenden Typ-2A-, Typ-2X- und gemischten Typ-2A/2X-Fasern (Abbildung 2A). In beiden Datensätzen waren diese beiden Cluster durch eine geringe Anzahl gemischter Typ-1/2A-Fasern verbunden. Wie erwartet bestätigte die Überrepräsentationsanalyse der wichtigsten PC-Treiber, dass PC2 durch kontraktile und metabolische Signaturen bestimmt wurde (Abbildung 2B und Ergänzende Abbildungen 6D–E, Ergänzende Datensätze 5–6). Insgesamt zeigte sich, dass der MYH-basierte Fasertyp ausreichte, um die kontinuierliche Variation entlang PC2 zu erklären, mit Ausnahme der sogenannten 2X-Fasern, die über das gesamte Transkriptom innerhalb des schnellen Clusters verteilt waren.
A. Hauptkomponentenanalyse (PCA) von Transkriptom- und Proteomdatensätzen, farblich dargestellt nach Fasertyp (basierend auf MYH). B. Anreicherungsanalyse von Transkript- und Protein-Treibern in PC2 und PC1. Die statistische Analyse erfolgte mit dem ClusterProfiler-Paket und Benjamini-Hochberg-korrigierten p-Werten. C, D. PCA-Plots, farblich dargestellt nach Gen-Ontologie-Termen (GO) für interzelluläre Adhäsion im Transkriptom und Costamer-GO-Termen im Proteom. Pfeile repräsentieren Transkript- und Protein-Treiber und ihre Richtung. E, F. UMAP-Feature-Plots (Uniform Manifold Approximation and Projection) klinisch relevanter Merkmale mit Expressionsgradienten unabhängig vom Fasertyp (langsam/schnell). G, H. Korrelationen zwischen PC2- und PC1-Treibern in Transkriptomen und Proteomen.
Überraschenderweise erklärte der MYH-basierte Muskelfasertyp nur den zweithöchsten Anteil der Variabilität (PC2), was darauf hindeutet, dass andere, vom MYH-basierten Muskelfasertyp unabhängige biologische Faktoren (PC1) eine wichtige Rolle bei der Regulation der Heterogenität von Skelettmuskelfasern spielen. Die Überrepräsentationsanalyse der wichtigsten Einflussfaktoren in PC1 zeigte, dass die Variabilität in PC1 primär durch Zell-Zell-Adhäsion und Ribosomengehalt im Transkriptom sowie durch Costamere und ribosomale Proteine ​​im Proteom bestimmt wird (Abbildung 2B und Ergänzende Abbildungen 6D–E, Ergänzender Datensatz 7). Im Skelettmuskel verbinden Costamere die Z-Scheibe mit dem Sarkolemm und sind an der Kraftübertragung und Signalgebung beteiligt.²⁵ Annotierte PCA-Diagramme mit Zell-Zell-Adhäsionsmerkmalen (Transkriptom, Abbildung 2C) und Costamerenmerkmalen (Proteom, Abbildung 2D) zeigten eine starke Linksverschiebung in PC1, was darauf hindeutet, dass diese Merkmale in bestimmten Fasern angereichert sind.
Eine detailliertere Untersuchung der Myofiber-Clusterbildung auf UMAP-Ebene zeigte, dass die meisten Merkmale einen myofiber-typunabhängigen, MYH-basierten Expressionsgradienten aufwiesen, anstatt einer Myofiber-Subcluster-spezifischen Expression. Diese Kontinuität wurde für mehrere Gene beobachtet, die mit pathologischen Zuständen assoziiert sind (Abbildung 2E), wie z. B. CHCHD10 (neuromuskuläre Erkrankung), SLIT3 (Muskelatrophie) und CTDNEP1 (Muskelerkrankung). Diese Kontinuität zeigte sich auch im gesamten Proteom, einschließlich Proteinen, die mit neurologischen Erkrankungen (UGDH), Insulin-Signalisierung (PHIP) und Transkription (HIST1H2AB) assoziiert sind (Abbildung 2F). Zusammengenommen deuten diese Daten auf eine Kontinuität der fasertypunabhängigen Heterogenität von langsamen und schnellen Muskelzuckungen in verschiedenen Myofibern hin.
Interessanterweise zeigten die Treibergene in PC2 eine gute Korrelation zwischen Transkriptom und Proteom (r = 0,663) (Abbildung 2G), was darauf hindeutet, dass langsame und schnelle Muskelfasertypen und insbesondere die kontraktilen und metabolischen Eigenschaften von Skelettmuskelfasern transkriptionell reguliert werden. Die Treibergene in PC1 zeigten hingegen keine Korrelation zwischen Transkriptom und Proteom (r = -0,027) (Abbildung 2H), was darauf schließen lässt, dass Variationen, die nicht mit langsamen/schnellen Muskelfasertypen zusammenhängen, größtenteils posttranskriptionell reguliert werden. Da die Variationen in PC1 primär durch ribosomale Gen-Ontologie-Terme erklärt wurden und Ribosomen eine entscheidende und spezialisierte Rolle in der Zelle spielen, indem sie aktiv an der Proteinübersetzung beteiligt sind und diese beeinflussen,³¹ untersuchten wir anschließend diese unerwartete ribosomale Heterogenität.
Zunächst färbten wir die Hauptkomponentenanalyse der Proteomikdaten entsprechend der relativen Häufigkeit der Proteine ​​im GOCC-Term „zytoplasmatisches Ribosom“ ein (Abbildung 3A). Obwohl dieser Term auf der positiven Seite von PC1 angereichert ist und dadurch einen geringen Gradienten aufweist, treiben ribosomale Proteine ​​die Partitionierung in beide Richtungen von PC1 voran (Abbildung 3A). Zu den auf der negativen Seite von PC1 angereicherten ribosomalen Proteinen gehörten RPL18, RPS18 und RPS13 (Abbildung 3B), während RPL31, RPL35 und RPL38 (Abbildung 3C) die Haupttreiber auf der positiven Seite von PC1 waren. Interessanterweise waren RPL38 und RPS13 im Skelettmuskel im Vergleich zu anderen Geweben stark exprimiert (Ergänzende Abbildung 7A). Diese charakteristischen ribosomalen Signaturen in PC1 wurden im Transkriptom nicht beobachtet (Ergänzende Abbildung 7B), was auf eine posttranskriptionelle Regulation hindeutet.
A. Hauptkomponentenanalyse (PCA), farblich dargestellt nach den GO-Termen (Gene Ontology) zytoplasmatischer ribosomaler Proteine ​​im gesamten Proteom. Pfeile zeigen die Richtung der proteinvermittelten Variation in der PCA-Darstellung an. Die Linienlänge entspricht dem Hauptkomponentenwert für das jeweilige Protein. B, C. PCA-Feature-Plots für RPS13 und RPL38. D. Unüberwachte hierarchische Clusteranalyse zytoplasmatischer ribosomaler Proteine. E. Strukturmodell des 80S-Ribosoms (PDB: 4V6X) mit Hervorhebung ribosomaler Proteine ​​unterschiedlicher Häufigkeit in Skelettmuskelfasern. F. Ribosomale Proteine ​​unterschiedlicher Stöchiometrie in der Nähe des mRNA-Exit-Kanals.
Die Konzepte der ribosomalen Heterogenität und Spezialisierung wurden bereits zuvor beschrieben. Demnach kann das Vorhandensein unterschiedlicher Ribosomen-Subpopulationen (ribosomale Heterogenität) die Proteinübersetzung in verschiedenen Geweben³² und Zellen³³ durch die selektive Translation spezifischer mRNA-Transkriptpools³⁴ (ribosomale Spezialisierung) direkt beeinflussen. Um Subpopulationen von ribosomalen Proteinen zu identifizieren, die in Skelettmuskelfasern koexprimiert werden, führten wir eine unüberwachte hierarchische Clusteranalyse ribosomaler Proteine ​​im Proteom durch (Abbildung 3D, Ergänzende Daten 8). Wie erwartet, clusterten die ribosomalen Proteine ​​nicht nach Fasertyp basierend auf MYH. Wir identifizierten jedoch drei distinkte Cluster ribosomaler Proteine: Der erste Cluster (ribosomal_cluster_1) wird mit RPL38 koreguliert und zeigt daher eine erhöhte Expression in Fasern mit einem positiven PC1-Profil. Der zweite Cluster (ribosomal_cluster_2) wird mit RPS13 koreguliert und ist in Fasern mit einem negativen PC1-Profil erhöht. Das dritte Cluster (ribosomal_cluster_3) zeigt keine koordinierte differentielle Expression in Skelettmuskelfasern und kann als das „Kern“-Ribosomenprotein des Skelettmuskels betrachtet werden. Die ribosomalen Cluster 1 und 2 enthalten beide ribosomale Proteine, die bekanntermaßen die alternative Translation regulieren (z. B. RPL10A, RPL38, RPS19 und RPS25) und die Entwicklung funktionell beeinflussen (z. B. RPL10A, RPL38).^{34,35,36,37,38} Im Einklang mit den PCA-Ergebnissen zeigte die beobachtete heterogene Repräsentation dieser ribosomalen Proteine ​​in den verschiedenen Fasern auch Kontinuität (Ergänzende Abbildung 7C).
Um die Lage heterogener ribosomaler Proteine ​​innerhalb des Ribosoms zu visualisieren, verwendeten wir ein Strukturmodell des humanen 80S-Ribosoms (Protein Data Bank: 4V6X) (Abbildung 3E). Nach der Isolierung ribosomaler Proteine ​​verschiedener ribosomaler Cluster war deren Lage nicht genau übereingestimmt, was darauf hindeutet, dass unser Ansatz keine Anreicherung bestimmter Regionen/Fraktionen des Ribosoms ermöglichte. Interessanterweise war der Anteil der Proteine ​​der großen Untereinheit in Cluster 2 jedoch geringer als in den Clustern 1 und 3 (Ergänzende Abbildung 7D). Wir beobachteten, dass Proteine ​​mit veränderter Stöchiometrie in Skelettmuskelfasern überwiegend an der Ribosomenoberfläche lokalisiert waren (Abbildung 3E), was mit ihrer Fähigkeit übereinstimmt, mit internen Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) in verschiedenen mRNA-Populationen zu interagieren und dadurch die selektive Translation zu koordinieren. 40, 41 Darüber hinaus befanden sich viele Proteine ​​mit veränderter Stöchiometrie in Skelettmuskelfasern in der Nähe funktioneller Regionen wie dem mRNA-Exit-Tunnel (Abbildung 3F), der selektiv die Translationselongation und den Stopp spezifischer Peptide reguliert. 42 Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass die Stöchiometrie ribosomaler Proteine ​​im Skelettmuskel heterogen ist, was zu Unterschieden zwischen den Skelettmuskelfasern führt.
Anschließend identifizierten wir Signaturen von schnell- und langsamzuckenden Muskelfasern und untersuchten die Mechanismen ihrer transkriptionellen Regulation. Durch Vergleich der mittels UMAP in den beiden Datensätzen definierten Cluster schnell- und langsamzuckender Muskelfasern (Abbildungen 1G–H und 4A–B) konnten transkriptomische und proteomische Analysen 1366 bzw. 804 differentiell exprimierte Merkmale identifizieren (Abbildungen 4A–B, Ergänzende Datensätze 9–12). Wir beobachteten die erwarteten Unterschiede in Signaturen, die mit Sarkomeren (z. B. Tropomyosin und Troponin), der Erregungs-Kontraktions-Kopplung (SERCA-Isoformen) und dem Energiestoffwechsel (z. B. ALDOA und CKB) in Zusammenhang stehen. Darüber hinaus zeigten Transkripte und Proteine, die die Protein-Ubiquitinierung regulieren, eine differentielle Expression in schnell- und langsamzuckenden Muskelfasern (z. B. USP54, SH3RF2, USP28 und USP48) (Abbildungen 4A–B). Darüber hinaus war das mikrobielle Proteingen RP11-451G4.2 (DWORF), dessen differentielle Expression in verschiedenen Muskelfasertypen von Lammmuskeln bereits beschrieben wurde⁴³ und das die SERCA-Aktivität im Herzmuskel erhöht⁴⁴, in langsam kontrahierenden Skelettmuskelfasern signifikant hochreguliert (Abbildung 4A). Auch auf Ebene einzelner Fasern wurden signifikante Unterschiede in bekannten Signaturen beobachtet, wie z. B. in Stoffwechsel-bezogenen Laktatdehydrogenase-Isoformen (LDHA und LDHB, Abbildung 4C und Ergänzende Abbildung 8A)^45,46 sowie in bisher unbekannten fasertypspezifischen Signaturen (wie IRX3, USP54, USP28 und DPYSL3) (Abbildung 4C). Es zeigte sich eine signifikante Überlappung differentiell exprimierter Merkmale zwischen den Transkriptom- und Proteomdaten (Ergänzende Abbildung 8B) sowie eine Korrelation der Expressionsänderung, die hauptsächlich durch die ausgeprägtere differentielle Expression von Sarkomermerkmalen bedingt war (Ergänzende Abbildung 8C). Bemerkenswerterweise zeigten einige Signaturen (z. B. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) eine starke posttranskriptionelle Regulation nur auf proteomischer Ebene und wiesen fasertypspezifische Expressionsprofile für langsame/schnelle Zuckungen auf (Ergänzende Abbildung 8C).
A und B: Vulkanplots vergleichen langsame und schnelle Cluster, die mithilfe der UMAP-Plots (Uniform Manifold Approximation and Projection) in Abbildung 1G–H identifiziert wurden. Farbige Punkte repräsentieren Transkripte oder Proteine ​​mit signifikanten Unterschieden (FDR < 0,05), dunklere Punkte solche mit signifikanten Unterschieden (log-Änderung > 1). Die statistische Analyse erfolgte mittels DESeq2-Wald-Test mit Benjamini-Hochberg-korrigierten p-Werten (Transkriptomik) bzw. mittels Limma-Modell mit empirischer Bayes-Analyse und anschließender Benjamini-Hochberg-Korrektur für multiple Vergleiche (Proteomik). C: Signaturplots ausgewählter differentiell exprimierter Gene oder Proteine ​​zwischen langsamen und schnellen Fasern. D: Anreicherungsanalyse signifikant differentiell exprimierter Transkripte und Proteine. Überlappende Werte sind in beiden Datensätzen angereichert, Transkriptomwerte nur im Transkriptom und Proteomwerte nur im Proteom. Die statistische Analyse erfolgte mit dem ClusterProfiler-Paket und Benjamini-Hochberg-korrigierten p-Werten. E. Fasertypspezifische Transkriptionsfaktoren, identifiziert durch SCENIC basierend auf SCENIC-abgeleiteten Regulator-Spezifitätswerten und differentieller mRNA-Expression zwischen Fasertypen. F. Profilierung ausgewählter Transkriptionsfaktoren mit differentieller Expression zwischen langsamen und schnellen Fasern.
Anschließend führten wir eine Überrepräsentationsanalyse differentiell repräsentierter Gene und Proteine ​​durch (Abbildung 4D, Ergänzender Datensatz 13). Die Anreicherung von Signalwegen für Merkmale, die sich zwischen den beiden Datensätzen unterschieden, zeigte erwartete Unterschiede, wie z. B. Fettsäure-β-Oxidation und Ketonstoffwechsel (langsame Fasern), Myofilament-/Muskelkontraktion (schnelle bzw. langsame Fasern) und Kohlenhydratabbau (schnelle Fasern). Die Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Aktivität war in schnellen Fasern ebenfalls erhöht, bedingt durch Merkmale wie die regulatorischen und katalytischen Phosphatase-Untereinheiten (PPP3CB, PPP1R3D und PPP1R3A), die bekanntermaßen den Glykogenstoffwechsel regulieren (47) (Ergänzende Abbildungen 8D–E). Weitere in schnellen Muskelfasern angereicherte Signalwege umfassten die Verarbeitung von P-Körpern (YTHDF3, TRIM21, LSM2) im Proteom (Abb. S8F), die möglicherweise an der posttranskriptionellen Regulation beteiligt sind (48), sowie die Aktivität von Transkriptionsfaktoren (SREBF1, RXRG, RORA) im Transkriptom (Abb. S8G). Langsame Muskelfasern wiesen eine Anreicherung von Oxidoreduktaseaktivität (BDH1, DCXR, TXN2) (Abb. S8H), Amidbindung (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Abb. S8I), extrazellulärer Matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Abb. S8J) und Rezeptor-Ligand-Aktivität (FNDC5, SPX, NENF) (Abb. S8K) auf.
Um die transkriptionelle Regulation, die den Eigenschaften von langsamen und schnellen Muskelfasern zugrunde liegt, genauer zu untersuchen, führten wir eine Transkriptionsfaktor-Anreicherung mit SCENIC49 durch (Ergänzender Datensatz 14). Zahlreiche Transkriptionsfaktoren zeigten eine signifikante Anreicherung zwischen schnellen und langsamen Muskelfasern (Abbildung 4E). Dazu gehörten Transkriptionsfaktoren wie MAFA, das bereits mit der Entwicklung schneller Muskelfasern in Verbindung gebracht wurde⁵⁰, sowie mehrere Transkriptionsfaktoren, die bisher nicht mit muskelfaserspezifischen Genprogrammen assoziiert waren. Unter diesen waren PITX1, EGR1 und MYF6 die am stärksten angereicherten Transkriptionsfaktoren in schnellen Muskelfasern (Abbildung 4E). Im Gegensatz dazu waren ZSCAN30 und EPAS1 (auch bekannt als HIF2A) die am stärksten angereicherten Transkriptionsfaktoren in langsamen Muskelfasern (Abbildung 4E). Entsprechend wurde MAFA in der UMAP-Region, die schnellen Muskelfasern entspricht, stärker exprimiert, während EPAS1 das entgegengesetzte Expressionsmuster aufwies (Abbildung 4F).
Neben bekannten proteinkodierenden Genen existieren zahlreiche nicht-kodierende RNA-Biotypen, die an der Regulation der menschlichen Entwicklung und von Krankheiten beteiligt sein könnten.^{51, 52} In Transkriptomdaten zeigen mehrere nicht-kodierende RNAs eine Spezifität für bestimmte Muskelfasertypen (Abbildung 5A und ergänzender Datensatz 15), darunter LINC01405, das hochspezifisch für langsame Muskelfasern ist und in der Muskulatur von Patienten mit mitochondrialer Myopathie vermindert vorkommt.⁵³ Im Gegensatz dazu weist RP11-255P5.3, das dem Gen lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)⁵⁴ entspricht, eine Spezifität für schnelle Muskelfasern auf. Sowohl LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) als auch RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) weisen eine Spezifität für Skelettmuskelzellen auf (Ergänzende Abbildungen 9A–B) und besitzen keine bekannten kontraktilen Gene in ihrer 1 Mb großen genomischen Umgebung. Dies deutet darauf hin, dass sie eine spezialisierte Rolle bei der Regulation von Muskelfasertypen spielen, anstatt benachbarte kontraktile Gene zu regulieren. Die für langsame bzw. schnelle Muskelfasern spezifischen Expressionsprofile von LINC01405 bzw. RP11-255P5.3 wurden mittels RNAscope bestätigt (Abbildungen 5B–C).
A. Nicht-kodierende RNA-Transkripte werden in langsam und schnell kontrahierenden Muskelfasern signifikant reguliert. B. Repräsentative RNAscope-Bilder zeigen die Spezifität von LINC01405 und RP11-255P5.3 für langsam bzw. schnell kontrahierende Muskelfasern. Maßstabsbalken = 50 μm. C. Quantifizierung der myofiberspezifischen Expression nicht-kodierender RNA mittels RNAscope (n = 3 Biopsien von unabhängigen Individuen, Vergleich von schnellen und langsam kontrahierenden Muskelfasern innerhalb jedes Individuums). Die statistische Analyse erfolgte mittels zweiseitigem t-Test nach Student. Die Boxplots zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil; die Whisker markieren die Minimal- und Maximalwerte. D. Workflow zur De-novo-Identifizierung mikrobieller Proteine ​​(erstellt mit BioRender.com). E. Das mikrobielle Protein LINC01405_ORF408:17441:17358 wird spezifisch in langsamen Skelettmuskelfasern exprimiert (n = 5 Biopsien von unabhängigen Probanden, Vergleich von schnellen und langsamen Muskelfasern jedes Probanden). Die statistische Analyse erfolgte mittels des linearen Limm-Modells in Kombination mit einem empirischen Bayes’schen Ansatz, gefolgt von der Benjamini-Hochberg-Methode für multiple Vergleiche mit p-Wert-Korrektur. Die Boxplots zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil; die Whisker markieren die Maximal- und Minimalwerte.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass viele mutmaßliche nicht-kodierende Transkripte transkribierte mikrobielle Proteine ​​kodieren, von denen einige die Muskelfunktion regulieren.^{44, 55} Um mikrobielle Proteine ​​mit potenzieller Fasertypspezifität zu identifizieren, durchsuchten wir unseren Proteomdatensatz von 1000 Muskelfasern mithilfe einer benutzerdefinierten FASTA-Datei, die die Sequenzen nicht-kodierender Transkripte (n = 305) aus diesem Datensatz enthielt (Abbildung 5D). Wir identifizierten 197 mikrobielle Proteine ​​aus 22 verschiedenen Transkripten, von denen 71 zwischen langsamen und schnellen Skelettmuskelfasern differentiell reguliert waren (Ergänzende Abbildung 9C und Ergänzender Datensatz 16). Für LINC01405 wurden drei mikrobielle Proteinprodukte identifiziert, von denen eines eine ähnliche Spezifität für langsame Muskelfasern wie sein Transkript aufwies (Abbildung 5E und Ergänzende Abbildung 9D). Somit identifizierten wir LINC01405 als ein Gen, das für ein mikrobielles Protein kodiert, das spezifisch für langsame Skelettmuskelfasern ist.
Wir entwickelten einen umfassenden Arbeitsablauf zur proteomischen Charakterisierung einzelner Muskelfasern im großen Maßstab und identifizierten Regulatoren der Faserheterogenität im gesunden Zustand. Diesen Arbeitsablauf wandten wir an, um zu verstehen, wie Nemalin-Myopathien die Heterogenität der Skelettmuskelfasern beeinflussen. Nemalin-Myopathien sind erbliche Muskelerkrankungen, die Muskelschwäche verursachen und bei betroffenen Kindern zu einer Reihe von Komplikationen wie Atemnot, Skoliose und eingeschränkter Beweglichkeit der Extremitäten führen.^19,20 Typischerweise führen pathogene Varianten in Genen wie Actin alpha 1 (ACTA1) bei Nemalin-Myopathien zu einem Überwiegen von langsam zuckenden Muskelfasern, wobei dieser Effekt jedoch heterogen ist. Eine bemerkenswerte Ausnahme bildet die Troponin-T1-Nemalin-Myopathie (TNNT1), bei der schnelle Muskelfasern überwiegen. Ein besseres Verständnis der Heterogenität, die der bei Nemalin-Myopathien beobachteten Dysregulation der Skelettmuskelfasern zugrunde liegt, könnte dazu beitragen, den komplexen Zusammenhang zwischen diesen Erkrankungen und dem jeweiligen Muskelfasertyp aufzuklären.
Im Vergleich zu gesunden Kontrollproben (n=3 pro Gruppe) zeigten Myofibrillen von Patienten mit Nemalin-Myopathie und Mutationen in den Genen ACTA1 und TNNT1 eine ausgeprägte Myofibrillenatrophie bzw. -dystrophie (Abbildung 6A, Ergänzungstabelle 3). Aufgrund der begrenzten Materialmenge stellte dies die Proteomanalyse vor erhebliche technische Herausforderungen. Dennoch konnten wir 2485 Proteine ​​in 272 Skelettmuskelfasern nachweisen. Nach der Filterung auf mindestens 1000 quantifizierte Proteine ​​pro Faser wurden 250 Fasern einer anschließenden bioinformatischen Analyse unterzogen. Nach der Filterung wurden durchschnittlich 1573 ± 359 Proteine ​​pro Faser quantifiziert (Ergänzungsabbildung 10A, Ergänzungsdatensätze 17–18). Bemerkenswerterweise war die Proteomtiefe der Proben von Patienten mit Nemalin-Myopathie trotz der signifikanten Reduktion der Fasergröße nur geringfügig verringert. Darüber hinaus ermöglichte die Verarbeitung dieser Daten mithilfe unserer eigenen FASTA-Dateien (einschließlich nicht-kodierender Transkripte) die Identifizierung von fünf mikrobiellen Proteinen in Skelettmuskelfasern von Patienten mit Nemalin-Myopathie (Ergänzender Datensatz 19). Der dynamische Bereich des Proteoms war deutlich größer, und die Gesamtproteinmenge in der Kontrollgruppe korrelierte gut mit den Ergebnissen einer früheren Proteomanalyse von 1000 Fasern (Ergänzende Abb. 10B–C).
A. Mikroskopische Aufnahmen zeigen Faseratrophie bzw. -dystrophie und die Dominanz verschiedener Fasertypen basierend auf MYH bei ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien (NM). Maßstabsbalken = 100 μm. Um die Reproduzierbarkeit der Färbung bei ACTA1- und TNNT1-Patienten zu gewährleisten, wurden Biopsien von drei Patienten zwei- bis dreimal gefärbt (vier Schnitte pro Fall), bevor repräsentative Bilder ausgewählt wurden. B. Faseranteile der Studienteilnehmer basierend auf MYH. C. Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Skelettmuskelfasern von Patienten mit Nemalin-Myopathien und Kontrollpersonen. D. Skelettmuskelfasern von Patienten mit Nemalin-Myopathien und Kontrollpersonen, projiziert auf eine PCA-Kurve, die aus den 1000 in Abbildung 2 analysierten Fasern erstellt wurde. Beispielsweise Vulkanplots zum Vergleich der Unterschiede zwischen Studienteilnehmern mit ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien und Kontrollpersonen sowie zwischen Studienteilnehmern mit ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien. Farbige Kreise kennzeichnen Proteine ​​mit signifikanten Unterschieden (π < 0,05), dunkle Punkte solche mit signifikanten Unterschieden (FDR < 0,05). Die statistische Analyse erfolgte mittels des linearen Limma-Modells und empirischer Bayes'scher Methoden, gefolgt von einer p-Wert-Korrektur für multiple Vergleiche nach Benjamini-Hochberg. H. Anreicherungsanalyse signifikant differentiell exprimierter Proteine ​​im gesamten Proteom sowie in Typ-1- und Typ-2A-Fasern. Die statistische Analyse erfolgte mit dem ClusterProfiler-Paket und Benjamini-Hochberg-korrigierten p-Werten. I, J. Hauptkomponentenanalyse (PCA), farblich dargestellt nach extrazellulärer Matrix und mitochondrialen Gen-Ontologie-Termen (GO).
Da Nemalin-Myopathien den Anteil MYH-exprimierender Muskelfasertypen in der Skelettmuskulatur beeinflussen können,^19,20 untersuchten wir zunächst die MYH-exprimierenden Muskelfasertypen bei Patienten mit Nemalin-Myopathien und Kontrollpersonen. Wir bestimmten den Muskelfasertyp mithilfe einer unvoreingenommenen Methode, die zuvor für den 1000-Muskelfaser-Assay beschrieben wurde (Ergänzende Abb. 10D–E), und konnten erneut keine reinen 2X-Muskelfasern identifizieren (Abb. 6B). Wir beobachteten einen heterogenen Effekt der Nemalin-Myopathien auf den Muskelfasertyp: Zwei Patienten mit ACTA1-Mutationen wiesen einen erhöhten Anteil an Typ-1-Muskelfasern auf, während zwei Patienten mit TNNT1-Nemalin-Myopathie einen verringerten Anteil an Typ-1-Muskelfasern zeigten (Abb. 6B). Tatsächlich war die Expression von MYH2 und schnellen Troponin-Isoformen (TNNC2, TNNI2 und TNNT3) bei ACTA1-Nemalin-Myopathien verringert, während die MYH7-Expression bei TNNT1-Nemalin-Myopathien reduziert war (Ergänzende Abbildung 11A). Dies deckt sich mit früheren Berichten über einen heterogenen Wechsel der Muskelfasertypen bei Nemalin-Myopathien.^19,20 Wir bestätigten diese Ergebnisse mittels Immunhistochemie und stellten fest, dass Patienten mit ACTA1-Nemalin-Myopathie überwiegend Typ-1-Muskelfasern aufwiesen, während bei Patienten mit TNNT1-Nemalin-Myopathie das umgekehrte Muster zu beobachten war (Abbildung 6A).
Auf Ebene des Einzelfaser-Proteoms gruppierten sich Skelettmuskelfasern von Patienten mit ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathie mit dem Großteil der Kontrollfasern, wobei die Fasern der TNNT1-Nemalin-Myopathie im Allgemeinen am stärksten betroffen waren (Abbildung 6C). Dies wurde besonders deutlich in den Hauptkomponentenanalyse-Plots (PCA) der pseudo-inflatierten Fasern für jeden Patienten. Die Patienten 2 und 3 mit TNNT1-Nemalin-Myopathie wiesen dabei den größten Abstand zu den Kontrollproben auf (Ergänzende Abbildung 11B, Ergänzender Datensatz 20). Um die Fasern von Myopathie-Patienten besser mit denen gesunder Fasern vergleichen zu können, nutzten wir detaillierte Informationen aus der Proteomanalyse von 1000 Fasern gesunder Erwachsener. Wir projizierten die Fasern des Myopathie-Datensatzes (Patienten mit ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathie sowie Kontrollen) auf den PCA-Plot der 1000-Faser-Proteomanalyse (Abbildung 6D). Die Verteilung der MYH-Fasertypen entlang der zweiten Hauptkomponente (PC2) in Kontrollfasern ähnelte der Faserverteilung aus der Proteomanalyse von 1000 Fasern. Die meisten Fasern von Patienten mit Nemalin-Myopathie verschoben sich jedoch entlang der PC2 nach unten und überlappten sich mit gesunden, schnellzuckenden Fasern, unabhängig von ihrem ursprünglichen MYH-Fasertyp. Obwohl Patienten mit ACTA1-Nemalin-Myopathie bei der Quantifizierung mittels MYH-basierter Methoden eine Verschiebung hin zu Typ-1-Fasern zeigten, führten sowohl die ACTA1- als auch die TNNT1-Nemalin-Myopathie zu einer Verschiebung des Skelettmuskelfaser-Proteoms hin zu schnellzuckenden Fasern.
Anschließend verglichen wir jede Patientengruppe direkt mit gesunden Kontrollpersonen und identifizierten 256 bzw. 552 differentiell exprimierte Proteine ​​bei ACTA1- bzw. TNNT1-Nemalin-Myopathien (Abbildung 6E–G und ergänzende Abbildung 11C, ergänzender Datensatz 21). Die Genanreicherungsanalyse zeigte eine koordinierte Abnahme mitochondrialer Proteine ​​(Abbildung 6H–I, ergänzender Datensatz 22). Überraschenderweise war diese Abnahme trotz der unterschiedlichen Häufigkeit verschiedener Fasertypen bei ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien völlig unabhängig vom MYH-basierten Fasertyp (Abbildung 6H und ergänzende Abbildungen 11D–I, ergänzender Datensatz 23). Drei mikrobielle Proteine ​​waren ebenfalls bei ACTA1- oder TNNT1-Nemalin-Myopathien reguliert. Zwei dieser Mikroproteine, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (auch bekannt als LINC00598 oder Lnc-FOXO1) und ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), zeigten eine differentielle Expression ausschließlich in Typ-1-Myofibrillen. ENSG00000215483_TR14_ORF67 spielt bekanntermaßen eine Rolle in der Zellzyklusregulation.⁵⁶ ENSG00000232046_TR1_ORF437 (entsprechend LINC01798) war hingegen sowohl in Typ-1- als auch in Typ-2A-Myofibrillen bei ACTA1-Nemalin-Myopathie im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöht (Ergänzende Abbildung 12A, Ergänzender Datensatz 24). Im Gegensatz dazu waren ribosomale Proteine ​​von der Nemalin-Myopathie weitgehend unbeeinflusst, obwohl RPS17 bei der ACTA1-Nemalin-Myopathie herunterreguliert war (Abb. 6E).
Die Anreicherungsanalyse zeigte zudem eine Hochregulierung von Prozessen des Immunsystems bei ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien, während die Zelladhäsion bei TNNT1-Nemalin-Myopathie ebenfalls erhöht war (Abbildung 6H). Die Anreicherung dieser extrazellulären Faktoren spiegelte sich in einer Verschiebung der PCA-Werte der extrazellulären Matrixproteine ​​in PC1 und PC2 in negativer Richtung (d. h. hin zu den am stärksten betroffenen Fasern) wider (Abbildung 6J). Beide Patientengruppen wiesen eine erhöhte Expression extrazellulärer Proteine ​​auf, die an Immunreaktionen und Reparaturmechanismen des Sarkolemms beteiligt sind, wie z. B. Annexine (ANXA1, ANXA2, ANXA5)^57,58 und deren Interaktionspartner S100A1¹¹⁵⁹ (Ergänzende Abbildungen 12B–C). Dieser Prozess wurde bereits bei Muskeldystrophien beschrieben⁶⁰, ist aber unseres Wissens bisher nicht mit Nemalin-Myopathien in Verbindung gebracht worden. Die normale Funktion dieser molekularen Maschinerie ist für die Reparatur des Sarkolemms nach einer Verletzung und für die Fusion neu gebildeter Myozyten mit Myofibrillen erforderlich.58,61 Die erhöhte Aktivität dieses Prozesses in beiden Patientengruppen deutet daher auf eine Reparaturreaktion auf eine durch Myofibrilleninstabilität verursachte Verletzung hin.
Die Effekte der einzelnen Nemalin-Myopathien korrelierten gut (r = 0,736) und zeigten eine beträchtliche Überlappung (Ergänzende Abbildungen 11A–B), was darauf hindeutet, dass ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathie ähnliche Auswirkungen auf das Proteom haben. Einige Proteine ​​waren jedoch nur bei ACTA1- oder TNNT1-Nemalin-Myopathie reguliert (Ergänzende Abbildungen 11A und C). Das profibrotische Protein MFAP4 war eines der am stärksten hochregulierten Proteine ​​bei TNNT1-Nemalin-Myopathie, blieb aber bei ACTA1-Nemalin-Myopathie unverändert. SKIC8, eine Komponente des PAF1C-Komplexes, der für die Regulation der HOX-Gentranskription verantwortlich ist, war bei TNNT1-Nemalin-Myopathie herunterreguliert, aber bei ACTA1-Nemalin-Myopathie nicht betroffen (Ergänzende Abbildung 11A). Ein direkter Vergleich der ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathie zeigte eine stärkere Reduktion mitochondrialer Proteine ​​und eine Zunahme von Proteinen des Immunsystems bei der TNNT1-Nemalin-Myopathie (Abbildung 6G–H und ergänzende Abbildungen 11C und 11H–I). Diese Daten korrelieren mit der stärkeren Atrophie/Dystrophie, die bei der TNNT1-Nemalin-Myopathie im Vergleich zur TNNT1-Nemalin-Myopathie beobachtet wurde (Abbildung 6A), was darauf hindeutet, dass die TNNT1-Nemalin-Myopathie eine schwerere Form der Erkrankung darstellt.
Um zu beurteilen, ob die beobachteten Effekte der Nemalin-Myopathie auf Ebene des gesamten Muskels bestehen bleiben, führten wir eine proteomische Analyse von Muskelbiopsien derselben Kohorte von Patienten mit TNNT1-Nemalin-Myopathie durch und verglichen diese mit Kontrollproben (n=3 pro Gruppe) (Abb. S13A, Ergänzender Datensatz 25). Wie erwartet, zeigten die Kontrollproben in der Hauptkomponentenanalyse eine hohe Korrelation, während die Patienten mit TNNT1-Nemalin-Myopathie eine höhere Variabilität zwischen den Proben aufwiesen, ähnlich der in der Einzelfaseranalyse beobachteten (Abb. S13B). Die Analyse des Gesamtproteins reproduzierte die differentiell exprimierten Proteine ​​(Abb. S13C, Ergänzender Datensatz 26) und biologischen Prozesse (Abb. S13D, Ergänzender Datensatz 27), die durch den Vergleich einzelner Fasern hervorgehoben wurden, verlor jedoch die Fähigkeit, zwischen verschiedenen Fasertypen zu unterscheiden und konnte die heterogenen Krankheitseffekte über die Fasern hinweg nicht erklären.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Proteomik einzelner Muskelfasern klinische und biologische Merkmale aufklären kann, die mit zielgerichteten Methoden wie Immunoblotting nicht nachweisbar sind. Darüber hinaus verdeutlichen diese Daten die Grenzen der alleinigen Verwendung der Aktinfasertypisierung (MYH) zur Beschreibung phänotypischer Anpassungen. Obwohl sich der Fasertypwechsel bei Aktin- und Troponin-Nemalin-Myopathien unterscheidet, entkoppeln beide Nemalin-Myopathien die MYH-Fasertypisierung vom Skelettmuskelfaserstoffwechsel hin zu einem schnelleren und weniger oxidativen Muskelproteom.
Zelluläre Heterogenität ist entscheidend dafür, dass Gewebe ihren vielfältigen Anforderungen gerecht werden können. In der Skelettmuskulatur wird dies häufig durch Fasertypen beschrieben, die sich durch unterschiedliche Kraftentwicklung und Ermüdbarkeit auszeichnen. Es ist jedoch klar, dass dies nur einen kleinen Teil der Variabilität der Skelettmuskelfasern erklärt, die deutlich variabler, komplexer und vielschichtiger ist als bisher angenommen. Technologische Fortschritte haben nun die Faktoren beleuchtet, die Skelettmuskelfasern regulieren. Unsere Daten legen nahe, dass Typ-2X-Fasern möglicherweise keinen eigenständigen Subtyp von Skelettmuskelfasern darstellen. Darüber hinaus identifizierten wir metabolische Proteine, ribosomale Proteine ​​und zellassoziierte Proteine ​​als wichtige Determinanten der Heterogenität von Skelettmuskelfasern. Durch die Anwendung unseres proteomischen Workflows auf Patientenproben mit Nematodenmyopathie konnten wir weiterhin zeigen, dass die MYH-basierte Fasertypisierung die Heterogenität der Skelettmuskulatur nicht vollständig widerspiegelt, insbesondere wenn das System gestört ist. Tatsächlich führt die Nematodenmyopathie unabhängig vom MYH-basierten Fasertyp zu einer Verschiebung hin zu schnelleren und weniger oxidativen Fasern.
Skelettmuskelfasern werden seit dem 19. Jahrhundert klassifiziert. Neuere Omics-Analysen ermöglichen es uns, die Expressionsprofile verschiedener MYH-Fasertypen und ihre Reaktionen auf unterschiedliche Stimuli zu verstehen. Wie hier beschrieben, bieten Omics-Ansätze zudem den Vorteil einer höheren Sensitivität bei der Quantifizierung von Fasertypmarkern im Vergleich zu traditionellen antikörperbasierten Methoden, ohne dass die Definition eines Skelettmuskelfasertyps auf der Quantifizierung eines einzelnen (oder weniger) Markers beruht. Wir verwendeten komplementäre transkriptomische und proteomische Arbeitsabläufe und integrierten die Ergebnisse, um die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation der Faserheterogenität in menschlichen Skelettmuskelfasern zu untersuchen. Dieser Arbeitsablauf führte dazu, dass wir in unserer Kohorte gesunder junger Männer keine reinen 2X-Fasern auf Proteinebene im Vastus lateralis identifizieren konnten. Dies deckt sich mit früheren Einzelfaserstudien, die weniger als 1 % reine 2X-Fasern im gesunden Vastus lateralis fanden, obwohl dies zukünftig in anderen Muskeln bestätigt werden sollte. Die Diskrepanz zwischen dem Nachweis nahezu reiner 2X-Fasern auf mRNA-Ebene und dem Nachweis von ausschließlich gemischten 2A/2X-Fasern auf Proteinebene ist rätselhaft. Die mRNA-Expression der MYH-Isoformen ist nicht zirkadian,⁶⁷ was darauf hindeutet, dass wir das MYH2-Onset-Signal in scheinbar reinen 2X-Fasern auf RNA-Ebene wahrscheinlich nicht „übersehen“ haben. Eine mögliche, wenn auch rein hypothetische Erklärung könnten Unterschiede in der Protein- und/oder mRNA-Stabilität zwischen den MYH-Isoformen sein. Tatsächlich ist keine schnelle Muskelfaser zu 100 % rein für irgendeine MYH-Isoform, und es ist unklar, ob MYH1-mRNA-Expressionswerte im Bereich von 70–90 % zu einer gleichen MYH1- und MYH2-Häufigkeit auf Proteinebene führen würden. Betrachtet man jedoch das gesamte Transkriptom oder Proteom, kann die Clusteranalyse unabhängig von der genauen MYH-Zusammensetzung zuverlässig nur zwei distinkte Cluster identifizieren, die langsame und schnelle Skelettmuskelfasern repräsentieren. Dies steht im Einklang mit Analysen mittels Einzelkern-Transkriptomik, die typischerweise nur zwei distinkte Myonuklearcluster identifizieren.^{68, 69, 70} Obwohl frühere Proteomstudien Typ-2X-Fasern identifiziert haben, bilden diese Fasern keinen separaten Cluster zu den übrigen schnellen Muskelfasern und weisen im Vergleich zu anderen Fasertypen, basierend auf MYH, nur eine geringe Anzahl differentiell exprimierter Proteine ​​auf.¹⁴ Diese Ergebnisse legen nahe, dass wir zur Klassifizierung von Muskelfasern aus dem frühen 20. Jahrhundert zurückkehren sollten, die menschliche Skelettmuskelfasern nicht in drei distinkte Klassen basierend auf MYH, sondern in zwei Cluster basierend auf ihren metabolischen und kontraktilen Eigenschaften unterteilte.⁶³
Wichtiger noch: Die Heterogenität der Muskelfasern sollte multidimensional betrachtet werden. Frühere Omics-Studien wiesen bereits in diese Richtung und legten nahe, dass Skelettmuskelfasern keine diskreten Cluster bilden, sondern ein Kontinuum bilden.^{11, 13, 14, 64, 71} Wir zeigen hier, dass sich Muskelfasern neben Unterschieden in ihren kontraktilen und metabolischen Eigenschaften auch durch Merkmale differenzieren lassen, die mit Zell-Zell-Interaktionen und Translationsmechanismen zusammenhängen. Tatsächlich fanden wir eine Ribosomenheterogenität in Skelettmuskelfasern, die unabhängig von langsamen und schnellen Fasertypen zur Heterogenität beiträgt. Die Ursache dieser beträchtlichen Heterogenität der Muskelfasern, unabhängig vom Fasertyp, ist noch unklar. Sie könnte jedoch auf eine spezialisierte räumliche Organisation innerhalb der Muskelfaszikel hinweisen, die optimal auf spezifische Kräfte und Belastungen reagiert,⁷² auf eine spezialisierte zelluläre oder organspezifische Kommunikation mit anderen Zelltypen in der Muskelmikroumgebung^{73, 74, 75} oder auf Unterschiede in der Ribosomenaktivität innerhalb einzelner Muskelfasern. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass ribosomale Heteroplasmie, sei es durch paraloge Substitution von RPL3 und RPL3L oder auf der Ebene der 2′-O-Methylierung der rRNA, mit Skelettmuskelhypertrophie assoziiert ist^76,77. Multi-omische und räumliche Anwendungen in Kombination mit der funktionellen Charakterisierung einzelner Muskelfasern werden unser Verständnis der Muskelbiologie auf multi-omischer Ebene weiter verbessern⁷⁸.
Durch die Analyse der Proteome einzelner Muskelfasern von Patienten mit Nemalin-Myopathien konnten wir den Nutzen, die Effektivität und die Anwendbarkeit der Einzelmuskelfaser-Proteomik zur Aufklärung der klinischen Pathophysiologie der Skelettmuskulatur demonstrieren. Darüber hinaus konnten wir durch den Vergleich unseres Arbeitsablaufs mit globalen Proteomanalysen zeigen, dass die Einzelmuskelfaser-Proteomik die gleiche Informationstiefe wie die globale Gewebeproteomik liefert und diese durch die Berücksichtigung der Heterogenität zwischen den Fasern und des Muskelfasertyps erweitert. Zusätzlich zu den erwarteten (wenn auch variablen) Unterschieden im Fasertypverhältnis, die bei ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien im Vergleich zu gesunden Kontrollen beobachtet wurden,¹⁹ beobachteten wir auch oxidative und extrazelluläre Umbauprozesse, die unabhängig vom MYH-vermittelten Fasertypwechsel sind. Fibrose wurde bereits bei TNNT1-Nemalin-Myopathien beschrieben.¹⁹ Unsere Analyse erweitert diesen Befund jedoch durch die zusätzliche Feststellung erhöhter Konzentrationen extrazellulär sezernierter Stressproteine, wie z. B. Annexine, die an Reparaturmechanismen des Sarkolemms beteiligt sind, in Muskelfasern von Patienten mit ACTA1- und TNNT1-Nemalin-Myopathien.^57,58,59 Zusammenfassend lässt sich sagen, dass erhöhte Annexin-Konzentrationen in Muskelfasern von Patienten mit Nemalin-Myopathie eine zelluläre Reaktion zur Reparatur stark atrophierter Muskelfasern darstellen könnten.
Obwohl diese Studie die bisher größte Einzelfaser-Omics-Analyse des menschlichen Muskels darstellt, weist sie Einschränkungen auf. Wir isolierten Skelettmuskelfasern aus einer relativ kleinen und homogenen Stichprobe von Probanden und einem einzigen Muskel (dem Vastus lateralis). Daher lässt sich die Existenz spezifischer Faserpopulationen in verschiedenen Muskeltypen und unter extremen Bedingungen der Muskelphysiologie nicht ausschließen. Beispielsweise können wir nicht ausschließen, dass bei hochtrainierten Sprintern und/oder Kraftsportlern⁷⁹ oder während Phasen muskulärer Inaktivität^66,80 eine Untergruppe ultraschneller Fasern (z. B. reine 2X-Fasern) auftritt. Darüber hinaus verhinderte die geringe Stichprobengröße die Untersuchung von Geschlechtsunterschieden in der Faserheterogenität, da bekannt ist, dass sich die Fasertypenverhältnisse zwischen Männern und Frauen unterscheiden. Des Weiteren konnten wir keine Transkriptom- und Proteomanalysen an denselben Muskelfasern oder Proben derselben Probanden durchführen. Während wir und andere weiterhin Einzelzell- und Einzelmuskelfaseranalysen mithilfe von Omics-Analysen optimieren, um einen extrem niedrigen Probeninput zu erreichen (wie hier in der Analyse von Fasern von Patienten mit mitochondrialer Myopathie gezeigt), wird die Möglichkeit deutlich, Multi-Omics- (und funktionelle) Ansätze innerhalb einzelner Muskelfasern zu kombinieren.
Insgesamt identifizieren und erklären unsere Daten transkriptionelle und posttranskriptionelle Faktoren, die die Heterogenität der Skelettmuskulatur bedingen. Insbesondere stellen wir mit unseren Daten ein lange etabliertes Dogma der Skelettmuskelphysiologie infrage, das mit der klassischen, auf MYH basierenden Definition von Fasertypen zusammenhängt. Wir hoffen, die Debatte neu zu entfachen und letztlich unser Verständnis der Klassifizierung und Heterogenität von Skelettmuskelfasern zu überdenken.
Vierzehn kaukasische Probanden (12 Männer und 2 Frauen) erklärten sich freiwillig zur Teilnahme an dieser Studie bereit. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Gent (BC-10237) genehmigt, entsprach der Deklaration von Helsinki von 2013 und wurde bei ClinicalTrials.gov (NCT05131555) registriert. Die allgemeinen Merkmale der Probanden sind in Tabelle S1 (im Anhang) dargestellt. Nach Einholung der mündlichen und schriftlichen Einwilligung unterzogen sich die Probanden vor dem endgültigen Studieneinschluss einer medizinischen Untersuchung. Die Probanden waren jung (22–42 Jahre), gesund (keine Vorerkrankungen, Nichtraucher) und mäßig körperlich aktiv. Die maximale Sauerstoffaufnahme wurde, wie bereits beschrieben, mittels eines Stufenergometers zur Beurteilung der körperlichen Fitness ermittelt.⁸¹
Muskelbiopsien wurden dreimal im Abstand von 14 Tagen im Ruhezustand und im nüchternen Zustand entnommen. Da diese Proben im Rahmen einer größeren Studie gewonnen wurden, nahmen die Teilnehmer 40 Minuten vor der Biopsie entweder ein Placebo (Laktose), einen H1-Rezeptorantagonisten (540 mg Fexofenadin) oder einen H2-Rezeptorantagonisten (40 mg Famotidin) ein. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Histaminrezeptorantagonisten die Ruhefunktion der Skelettmuskulatur nicht beeinflussen⁸¹, und in unseren Qualitätskontrolldiagrammen (Abbildungen 3 und 6 im Anhang) wurde keine zustandsabhängige Clusterbildung beobachtet. 48 Stunden vor jedem Versuchstag wurde eine standardisierte Diät (41,4 kcal/kg Körpergewicht, 5,1 g/kg Körpergewicht Kohlenhydrate, 1,4 g/kg Körpergewicht Protein und 1,6 g/kg Körpergewicht Fett) eingehalten, und am Morgen des Versuchstages wurde ein standardisiertes Frühstück (1,5 g/kg Körpergewicht Kohlenhydrate) eingenommen. Unter Lokalanästhesie (0,5 ml 1%iges Lidocain ohne Adrenalin) wurden Muskelbiopsien aus dem Musculus vastus lateralis mittels perkutaner Bergström-Aspiration entnommen.82 Die Muskelproben wurden sofort in RNAlater eingebettet und bis zur manuellen Faserdissektion (bis zu 3 Tage) bei 4°C gelagert.
Frisch isolierte Muskelfaserbündel wurden in frisches RNAlater-Medium in einer Kulturschale überführt. Anschließend wurden die einzelnen Muskelfasern manuell mithilfe eines Stereomikroskops und einer feinen Pinzette präpariert. Aus jeder Biopsie wurden 25 Fasern präpariert, wobei besonderes Augenmerk auf die Auswahl von Fasern aus verschiedenen Bereichen der Biopsie gelegt wurde. Nach der Präparation wurde jede Faser vorsichtig in 3 μl Lysepuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) mit Proteinase K und DNase getaucht, um unerwünschte Proteine ​​und DNA zu entfernen. Die Zelllyse und die Entfernung von Proteinen und DNA wurden durch kurzes Vortexen, Zentrifugieren der Flüssigkeit in einer Mikrozentrifuge und Inkubation bei Raumtemperatur (10 min) eingeleitet. Das Lysat wurde anschließend in einem Thermocycler (T100, Bio-Rad) 5 min bei 37 °C und 5 min bei 75 °C inkubiert und anschließend bis zur Weiterverarbeitung sofort bei -80 °C gelagert.
Aus 2 µl Myofiberlysat wurden mit dem QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) Illumina-kompatible polyadenylierte RNA-Bibliotheken hergestellt. Detaillierte Methodenbeschreibungen finden sich im Handbuch des Herstellers. Der Prozess beginnt mit der cDNA-Synthese des ersten Strangs mittels reverser Transkription. Dabei werden eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs) und probenspezifische i1-Barcodes eingeführt, um das Pooling der Proben zu gewährleisten und die technische Variabilität in der nachfolgenden Verarbeitung zu reduzieren. Die cDNA von 96 Myofibern wird anschließend gepoolt und mit Magnetbeads gereinigt. Danach wird die RNA entfernt und die Synthese des zweiten Strangs mit Zufallsprimern durchgeführt. Die Bibliothek wird erneut mit Magnetbeads gereinigt, mit poolspezifischen i5/i7-Tags versehen und mittels PCR amplifiziert. Ein abschließender Reinigungsschritt liefert Illumina-kompatible Bibliotheken. Die Qualität jedes Bibliothekspools wurde mit dem High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500) überprüft.
Basierend auf der Qubit-Quantifizierung wurden die Pools in äquimolaren Konzentrationen (2 nM) weiter vereinigt. Der resultierende Pool wurde dann auf einem NovaSeq 6000-Gerät im Standardmodus mit dem NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 Nukleotide) und einer Beladung von 2 nM (4 % PhiX) sequenziert.
Unsere Pipeline basiert auf der QuantSeq Pool-Datenanalyse-Pipeline von Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Die Daten wurden zunächst mit bcl2fastq2 (v2.20.0) anhand des i7/i5-Index demultiplext. Anschließend wurde Read 2 mit idemux (v0.1.6) anhand des i1-Proben-Barcodes demultiplext und die UMI-Sequenzen mit umi_tools (v1.0.1) extrahiert. Die Reads wurden dann in mehreren Durchgängen mit cutadapt (v3.4) getrimmt, um kurze Reads (<20 bp Länge) oder Reads, die ausschließlich aus Adaptersequenzen bestanden, zu entfernen. Die Reads wurden anschließend mit STAR (v2.6.0c) auf das humane Genom ausgerichtet und die BAM-Dateien mit SAMtools (v1.11) indiziert. Duplikate wurden mit umi_tools (v1.0.1) entfernt. Abschließend wurde die Alignment-Zählung mit featureCounts in Subread (v2.0.3) durchgeführt. Die Qualitätskontrolle erfolgte mit FastQC (v0.11.9) in mehreren Zwischenschritten der Pipeline.
Alle weiteren bioinformatischen Verarbeitungsschritte und Visualisierungen wurden in R (Version 4.2.3) durchgeführt, primär mithilfe des Seurat-Workflows (Version 4.4.0).⁸³ Daher wurden die einzelnen UMI-Werte und Metadatenmatrizen in Seurat-Objekte transformiert. Gene, die in weniger als 30 % aller Fasern exprimiert wurden, wurden entfernt. Proben mit geringer Qualität wurden anhand eines Mindestschwellenwerts von 1000 UMI-Werten und 1000 detektierten Genen ausgeschlossen. Schließlich bestanden 925 Fasern alle Qualitätskontrollfilter. Die UMI-Werte wurden mithilfe der Seurat SCTransform v2-Methode⁸⁴ unter Einbeziehung aller 7418 detektierten Merkmale normalisiert, und Unterschiede zwischen den Teilnehmern wurden herausgerechnet. Alle relevanten Metadaten sind im ergänzenden Datensatz 28 zu finden.